Этот протокол имеет важное значение, поскольку он предоставляет исследователям навыки для использования донорских человеческих сердец для доклинкического физиологического тестирования на наркотики. Эта ткань использует как напряжение, так и красители кальция для одновременной характеристики сердечных потенциалов действия и внутриклеточного кальция переходных в человеческих тканей ломтиками. Чтобы настроить оптическую картографическую систему, прикрепите тканевую ванну с нижним слоем полидиметилсилоксанового геля к системе перфузии и распространяем один литр восстановительного раствора при температуре 37 градусов по Цельсию, насыщенной 100%-ным кислородом через систему перфузии со скоростью потока достаточно быстро, чтобы поддерживать температуру и предотвращать накопление перфузы ванны.
Затем используйте цель, чтобы настроить фокус и выравнивание двух камер CMOS и использовать зеленый светодиодный источник света с длиной волны 520 плюс-минус пять нанометров, чтобы возбудить чувствительные к напряжению и красители индикатора кальция одновременно. Перед получением разделов тканей, смешать замороженные и жидкие раствор кардиоплегии и поместить сердечную ткань в ледяную ванну кардиоплегии и определить левый желудочковой свободной стенки. Клей предварительно сделанный гель агарозы к задней части металлических держателей ткани вибромы.
Вырезать один сантиметр кубированных блоков ткани в холодном кардиоплегическом растворе и использовать актуальные клей кожи быстро смонтировать блоки ткани на металлические держатели тканей с эндокарда поверхностей лицом вверх. Перенесите металлические держатели в вибрационную ванну ледяного кислородного нарезания раствора так, чтобы ткани были полностью погружены в воду и переместить лезвие к переднему краю ткани. Включите вибром, чтобы начать нарезку с заданными параметрами, отбрасывая первые несколько ломтиков, пока лезвие не достигнет за trabeculae в гладкой ткани эндокарда.
Когда экспериментальная ткань была достигнута, тщательно передать каждый ломтик в отдельных 100 микрометров нейлоновых сетчатых клеток ситечкой в культуре блюдо, содержащее комнатную температуру кислородом раствор восстановления Tyrode и покрыть ломтики сетки шайбы держать ткани ломтиками от керлинга. Когда все ломтики были собраны, тщательно перенесите каждый кусочек в отдельные колодцы из шести скважин пластины, содержащей три миллилитров PBS на скважину. Промыть ломтик с нежным качания и повторить этот процесс три раза со свежим стерильным PBS перед передачей образцов в отдельных скважин из шести скважин пластины, содержащей три миллилитров 37 градусов по Цельсию культуры среды на колодец.
Затем поместите пластину на орбитальный шейкер со 20 оборотами в минуту во влажном инкубаторе при 37 градусах, 30%кислороде и 5%углекислом газе. После 20 минут инкубации в восстановительном растворе для свежесрезанные ломтики или сразу же после культивирования, тщательно перенесите кусочек интереса к ванне ткани перфузионной системы и прикрепите четыре угла к гелевому слою, применяя минимальный участок к ткани. Разрешить ломтики отдохнуть в этой ванне с циркулирующим раствором восстановления в течение примерно 10 минут, прежде чем добавить 0,3 до 0,5 микролитров бульона Blebbistatin в резервуар восстановления раствора.
В то время как ломтик инкубирует в Blebbistatin, восстановить 30 микролитров запаса напряжения чувствительный краситель в один миллилитр раствора восстановления на 37 градусов. После 10 минут обработки Blebbistatin, выключите насосы и медленно загрузить 0,2 до 0,3 миллилитров рабочего раствора красителя на поверхность ломтика в течение 30 секунд. Через 90 секунд включите насосы, чтобы вымыть излишки красителя.
После смерти ломтик с запасом кальция индикатор, как только что продемонстрировали, сосредоточить камеры на ломтик и темп ломтик на один герц с двух миллисекундной шириной пульса продолжительность в 1,5 раза амплитуды предопределенного порога темпа. Поместите крышку над ломтиком ткани и осветите ломтик светодиодным источником света возбуждения. Затем замитмить испускаемое напряжение и кальций сигналами с помощью камер со скорости 1000 кадров в секунду.
Для состояния данных оптического картирования напряжения и кальция, в соответствующем программном обеспечении анализа, нажмите параметры состояния и удалите фон. Затем отрегулируйте параметры кондиционирования сигнала, чтобы получить оптимальный потенциал действия и преходящие следы кальция. Чтобы рассчитать скорость проводимости, выберите карту активации и введите время начала и окончания, чтобы охватить один потенциал действия в следе.
Затем нажмите на региональную карту и выберите область, интересную для отображения карты активации выбранного региона. Далее выберите карту скорости проводимости и выберите время начала и окончания. При необходимости отрегулируйте значения межми пиксельного разрешения на основе настройки.
Нажмите на карту вектора, чтобы выбрать область, представляющий интерес, и отобразить векторы скорости проводимости в этом регионе. Будет отображаться среднее, среднее, стандартное отклонение и количество векторов, включенных в анализ, а также средний угол распространения векторов скорости проводимости в выбранном регионе. Чтобы рассчитать потенциальную продолжительность действия, выберите потенциальную продолжительность действия, карту переходной продолжительности кальция и выберите время начала и конца, чтобы охватить один полный потенциал действия.
Затем нажмите региональный расчет потенциальной продолжительности действия, чтобы выбрать область, интересную и создать карту потенциальной продолжительности действия. Чтобы определить время подъема, выберите время подъема и выберите время начала и окончания, чтобы выбрать upstroke одного единственного потенциала действия или кальция переходных. Введите значения начала и конца процента и нажмите вычислить, чтобы выбрать область интереса и определить среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ времени роста.
Чтобы определить распад кальция, выберите распад кальция и введите время начала и конца, чтобы охватить всю часть распада одного переходного сигнала кальция. Затем нажмите вычислить тау, чтобы выбрать область интереса и определить среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ времени распада кальция. В этом репрезентативном эксперименте, потенциал действия и кальция переходные следы были обусловлены сигналом.
Время активации определялось для каждого пикселя, а изохрональные карты времени активации были построены по условным следам напряжения и кальция. Векторы скорости проводимости рассчитывались с использованием времени активации и известного межки пиксельного разрешения. Постоянная преходящая распада кальция измерялась путем установки полиномии на разлагающуюся часть следов кальция.
Потенциальная продолжительность действия и преходящая продолжительность кальция измерялись как продолжительность времени между временем активации и указанным процентом повторной поляризации или удаления кальция из цитоплазмы соответственно. Также были измерены и отображены время повышения напряжения и следов кальция. В этом репрезентативном анализе было проверено влияние доксорубицина на сердечное поведение, что привело к снижению скорости поперечного проведения.
Важно, чтобы убедиться, что ломтики находятся в полном кардиоплегическом аресте, чтобы свести к минимуму повреждение тканей во время процедуры нарезки и получить жизнеспособные ломтики. В конце протокола ломтики могут быть заморожены или зафиксированы для молекулярной оценки. Механистические пути, участвующие в электрофизиологическом явлении, представляющие интерес, могут быть определены.
Разработка этой модели сердечного среза человека позволила изучить реакцию на лечение и болезни в сердечной ткани человека, преодолев разрыв между исследованиями на животных и клинических исследованиях. При работе с человеческими тканями при выполнении этой техники, не забудьте носить соответствующие СИЗ и принимать любые другие необходимые меры предосторожности.
