Ce protocole est important parce qu’il fournit aux chercheurs les compétences nécessaires pour employer des cœurs humains de donneurs pour le dépistage physiologique préclinique des drogues. Ce tissu utilise à la fois la tension et les dyes de calcium pour la caractérisation simultanée des potentiels d’action cardiaque et des transitoires intracellulaires de calcium dans les tranches de tissu humain. Pour mettre en place le système de cartographie optique, fixez un bain tissulaire avec une couche de gel de polydiméthane fond à un système de perfusion et faites circuler un litre de solution de récupération à 37 degrés Celsius oxygéné avec 100% d’oxygène à travers le système de perfusion à un débit assez rapide pour maintenir la température et empêcher l’accumulation de perfusate de bain.
Ensuite, utilisez une cible pour ajuster la mise au point et l’alignement des deux caméras CMOS et utilisez une source de lumière LED verte avec une longueur d’onde de 520 plus ou moins cinq nanomètres pour exciter simultanément les sous-vêtements sensibles à la tension et aux indicateurs de calcium. Avant d’obtenir des sections tissulaires, mélanger la solution de cardioplégie congelée et liquide et placer le tissu cardiaque dans le bain cardioplégique glacé et identifier la paroi libre ventriculaire gauche. Collez le gel d’agarose pré-fait à l’arrière des porte-tissus métalliques du vibratome.
Coupez un centimètre de blocs cubes de tissu dans la solution cardioplégique froide et utilisez l’adhésif topique de peau pour monter rapidement les blocs de tissu sur les supports en métal de tissu avec les surfaces endocardial faisant face vers le haut. Transférez les supports métalliques dans le bain vibratoire de la solution de tranchage oxygéné froid de glace afin que les tissus soient complètement submergés et déplacent la lame vers le bord avant du tissu. Allumez le vibratome pour commencer à trancher avec les paramètres prédéfinis, en jetant les premières tranches plusieurs jusqu’à ce que la lame atteint au-delà du trabeculae dans le tissu endocardique lisse.
Lorsque le tissu expérimental a été atteint, transférez soigneusement chaque tranche dans des passoires cellulaires en nylon de 100 micromètres individuelles dans un plat de culture contenant la solution de récupération oxygénée à température ambiante de Tyrode et recouvrez les tranches de rondelles en maille pour empêcher les tranches de tissu de se courber. Lorsque toutes les tranches ont été recueillies, transférer soigneusement chaque tranche dans des puits individuels d’une plaque de six puits contenant trois millilitres de PBS par puits. Rincez la tranche avec un basculement doux et répétez ce processus trois fois avec du PBS stérile frais avant de transférer les échantillons dans des puits individuels d’une plaque de six puits contenant trois millilitres de milieu de culture de 37 degrés Celsius par puits.
Placez ensuite la plaque sur un shaker orbital à 20 révolutions par minute dans un incubateur humidifié à 37 degrés, 30% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone. Après 20 minutes d’incubation dans la solution de récupération pour les tranches fraîchement coupées ou immédiatement après la culture, transférez soigneusement la tranche d’intérêt au bain de tissu de système de perfusion et épinglez les quatre coins à la couche de gel tout en appliquant l’étirement minimal au tissu. Laisser reposer les tranches dans ce bain avec une solution de récupération circulante pendant environ 10 minutes avant d’ajouter 0,3 à 0,5 microlitres de stock Blebbistatin au réservoir de solution de récupération.
Pendant que la tranche couve dans la Blebbistatin, reconstituer 30 microlitres du colorant sensible à la tension du stock en un millilitre de solution de récupération à 37 degrés. Après 10 minutes de traitement à la blebbistatine, éteignez les pompes et chargez lentement 0,2 à 0,3 millilitres de solution de colorant de travail sur la surface de la tranche sur une période de 30 secondes. Après 90 secondes, allumez les pompes pour laver tout excès de colorant.
Après avoir perdu la tranche avec l’indicateur de calcium de stock comme juste démontré, concentrez les caméras sur la tranche et le rythme de la tranche à un hertz avec une durée de largeur d’impulsion de deux millisecondes à 1,5 fois l’amplitude du seuil de stimulation prédéterminé. Placez un coverslip sur la tranche de tissu et illuminez la tranche avec la source lumineuse d’excitation de LED. Ensuite, enregistrez les signaux de tension et de calcium émis avec les caméras à 1000 images par seconde.
Pour conditionner les données de cartographie optique de tension et de calcium, dans le logiciel d’analyse approprié, cliquez sur les paramètres de l’état et supprimez l’arrière-plan. Ajustez ensuite les paramètres de conditionnement du signal pour obtenir un potentiel d’action optimal et des traces transitoires de calcium. Pour calculer la vitesse de conduction, sélectionnez la carte d’activation et entrez une heure de début et de fin pour englober un potentiel d’action unique dans la trace.
Cliquez ensuite sur la carte régionale et sélectionnez la région d’intérêt pour afficher la carte d’activation de la région sélectionnée. Ensuite, sélectionnez la carte de vitesse de conduction et sélectionnez les heures de début et de fin. Ajustez les valeurs de résolution interpixélises en fonction de la configuration au besoin.
Cliquez sur générer une carte vectorielle pour sélectionner une région d’intérêt et afficher les vecteurs de vitesse de conduction dans cette région. L’écart moyen, médian, type et le nombre de vecteurs inclus dans l’analyse ainsi que l’angle moyen de propagation des vecteurs de vitesse de conduction dans la région sélectionnée seront affichés. Pour calculer la durée potentielle d’action, sélectionnez la durée potentielle d’action, la carte de durée transitoire en calcium et sélectionnez les heures de début et de fin pour englober un potentiel d’action complet.
Cliquez ensuite sur le calcul de la durée potentielle de l’action régionale pour sélectionner une région d’intérêt et générer la carte de durée potentielle d’action. Pour déterminer l’heure de montée, sélectionnez le temps d’élévation et sélectionnez les heures de début et de fin pour sélectionner la montée d’un seul potentiel d’action ou de calcium transitoire. Entrez les valeurs de pourcentage de début et de fin et cliquez sur calculer pour sélectionner la région d’intérêt et pour déterminer la moyenne, la médiane, l’écart type et le nombre de pixels inclus dans l’analyse du temps d’élévation.
Pour déterminer la désintégration du calcium, sélectionnez la carie calcique et entrez dans les heures de début et de fin pour englober la partie entière de décomposition d’un seul signal transitoire de calcium. Cliquez ensuite sur calculer tau pour sélectionner la région d’intérêt et pour déterminer la moyenne, médiane, écart type, et le nombre de pixels inclus dans l’analyse de la constante du temps de décomposition du calcium. Dans cette expérience représentative, le potentiel d’action et les traces transitoires de calcium ont été conditionnés de signal.
Les temps d’activation ont été déterminés pour chaque pixel et des cartes isochronales des temps d’activation ont été tracées à partir de la tension conditionnée et des traces de calcium. Les vecteurs de vitesse de conduction ont été calculés à l’aide des temps d’activation et de la résolution interpixélisée connue. La constante transitoire de décomposition de calcium a été mesurée en adaptant un polynomial à la partie en décomposition des traces de calcium.
La durée potentielle d’action et la durée transitoire de calcium ont été mesurées comme durée de temps entre le temps d’activation et un pourcentage spécifié de la repol polarisation ou de l’enlèvement de calcium du cytoplasme respectivement. Les temps d’élévation de la tension et les traces de calcium ont également été mesurés et cartographiés. Dans cette analyse représentative, l’effet de la doxorubicine sur la conduction cardiaque a été examiné ayant pour résultat une réduction de la vitesse transversale de conduction.
Il est important de s’assurer que les tranches sont en arrêt cardioplégique complet pour minimiser les dommages au tissu pendant la procédure de tranchage et pour obtenir des tranches viables. À la fin du protocole, les tranches peuvent être congelées ou fixées pour une évaluation moléculaire. Les voies mécanistes impliquées dans le phénomène électrophysiologique d’intérêt peuvent alors être déterminées.
Le développement de ce modèle de tranche cardiaque humaine a permis d’étudier les réponses aux traitements et aux maladies dans les tissus cardiaques humains, comblant l’écart entre les études animales et cliniques. Lorsque vous travaillez avec des tissus humains tout en exécutant cette technique, assurez-vous de porter l’EPI approprié et de prendre toutes les autres précautions de sécurité nécessaires.
