Este protocolo proporciona un esquema detallado de cómo co-cultivar células madre de pulpa dental con neuronas trigéminas. Con él, podemos investigar múltiples respuestas impulsadas por su interferencia. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar y manipular cualquiera o ambas poblaciones celulares y medir con precisión los resultados.
Este método tiene relevancia directa para la investigación neuronal y podría proporcionar información sobre la investigación sobre cómo las células madre de pulpa dental reparan el tejido neural dañado por eventos traumáticos o enfermedades neurodegenerativas. Hay varias etapas de esta técnica para aprender y puede ser difícil mantener el tracto de todos ellos. Este protocolo detalla cada etapa para ayudar con eso.
La pulpa dental y los ganglios son difíciles de dispersar y requieren varios vórtices y pipeteos. Incluso entonces no obtendrá una dispersión completa, por lo que se requerirá optimización y réplicas. Después de la eutanasia del ratón, coloque la cabeza en el panel inferior desechable para que la boca esté hacia el techo y la base del cuello sea plana en la superficie de trabajo.
Utilice una cuchilla de afeitar y un movimiento de aserrado para separar la mandíbula del maxilar. Retire la lengua con tijeras o fórceps para facilitar el acceso a los molares. Coloque la cabeza abierta en el plato sobre una gasa estéril y coloque la muestra debajo del microscopio de disección.
Retire el tejido óseo alveolar que rodea los primeros molares. Inserte los fórceps en la abertura alveolar y burlizar el tejido lejos del diente hacia el buceo o el lado lingual de la boca. Recoger todos los primeros molares maxilares y transferir suavemente los primeros molares submandibulares y maxilares a un plato de cultivo celular separado con 1X PBS en hielo.
Retire el órgano exterior del esmalte que rodea el exterior de cada primer molar maxilar. Con un conjunto de fórceps girar el molar para que las cúspides estén abajo y la raíz abierta se exponga. Hay una abertura ovalada en la parte inferior del diente y tejido de pulpa dental opaco encapsulado por una fina capa de dentina y esmalte.
Usando la punta de los fórceps, afloje suavemente la pulpa dental ejecutando un brazo de los fórceps alrededor de la circunferencia interna del tejido mineralizado. Retire el tejido de pulpa dental de la estructura mineralizada y transfiera a un tercer plato que contenga 1X PBS. Retire el órgano exterior del esmalte si aún no estaba separado.
Transfiera todo el tejido de pulpa dental al 0,25% de la trippsina EDTA en un tubo cónico de 50 mililitros. Vórtice la mezcla y colóquela en un baño de agua tibia de 37 grados Celsius durante 10 minutos. Bajo una capucha estéril, agregue medios de co-cultivo calentados a una proporción final de al menos medios uno a uno para tripina para inactivar la enzima.
Pipetee el medio hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de 10 mililitros para dispersar aún más la pulpa dental en los medios, evitar grandes burbujas. Transfiera un mililitro de la pulpa dental dispersa a cada pozo de la placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius.
Y permita que las células se adhieran y migren desde el tejido no disperso durante 48 horas antes de cambiar de medio. Después de la eutanasia y la eliminación de la piel, inserte la punta de un par de tijeras micro disección en la base del cráneo. Corte a lo largo de la sutura sagital del cráneo.
Haga cuatro pequeños cortes horizontales a lo largo de las suturas coronales por las orejas hasta que a lo largo de las suturas lambdoide de la base del cráneo. Esto crea dos colgajos de hueso. Usa los fórceps para despegar los dos colgajos del hueso para revelar el cerebro.
Localice los ganglios trigéminos alojados en la duramadre entre el cerebro y el hueso del proceso maxilar. Corta las tres ramas que viajan a los ojos, maxilares y mandíbulas. Y usa fórceps finos de borde recto para transferir los ganglios a 1X PBS frío en un plato sobre hielo.
Una vez que todos los paquetes trigéminales se cosechan utilizan fórceps de archivo para transferir ganglios a tubo cónico de 50 mililitros que contiene cinco miligramos por mililitro de colágeno filtrado estéril tipo II.Vortex la mezcla y colocar el tubo en el baño de agua de 37 grados Celsius durante 25 a 30 minutos. Cada cinco a diez minutos, saque el tubo del baño de agua, el vórtice y vuelva al baño. Centrifugar la solución de neurona trigémino de colagenasa durante dos minutos a 643xg.
Bajo una capucha de cultivo de tejido, aspira suavemente la colagenasa con un micropipet y añadir cinco mililitros de 1%estéril de trippsina filtrada tipo II.A continuación, coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 25 a 30 minutos y dentro de este marco de tiempo vórtice el tubo brevemente cada cinco minutos. Agregue medios en una relación uno a uno de tripsina a medios para desactivar la tripina restante. Contar el número de células y diluir la mezcla a 200.000 células por mililitro en medios.
Coloque los filtros transposos recubiertos en pozos con pulpa dental. Pipet 250 microlitros en el filtro de transpolío y cultivo de las células en 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, reemplace los medios con un mililitro de medios de co-cultivo complementados con una uridina micromolar y 15 micromolares 5-Fluoro-2'desoxiuridina para detener la proliferación excesiva de células mesenquimales que pueden prevenir el crecimiento de neurita.
Debe agregar inhibidores mitóticos en el día dos o no se producirá crecimiento de neurita. En este estudio, el crecimiento de la neurita trigéminal se incrementó en presencia de células primarias de pulpa dental en el pozo subyacente en comparación con el control del monocultivo de neurito trigémino. Las células primarias aisladas del ratón de flox/flox del receptor TGF-beta 2 eran equivalentes en número después de las inyecciones de ade-Cre-GFP o ade-eGFP.
La PCR semicuantitativa demuestra que el adenovirus-Cre-GFP eliminó el gen flanqueado que transforma el factor de crecimiento beta receptor 2 con adenovirus-eGFP sirviendo como vector viral de control. En las culturas con la transformación del factor de crecimiento beta receptor 2 deleción, el crecimiento de la neurita disminuyó. Las imágenes de campo brillante de los filtros transpojo después de la tinción violeta cristalina de las poblaciones celulares muestran que los poros grandes son frecuentes.
La flecha grande señala una célula con morfología mesenquimal mientras que la pequeña flecha apunta a una célula de morfología neuronal. Cristal violeta manchado ambas células sin sesgo. Además, la tinción por inmunofluorescencia de la tubulina beta-III con un anticuerpo secundario alexa 488 muestra la tinción no específica de múltiples células dificultando la toma de imágenes de estructuras aferentes.
Debido a que ni las células de pulpa dental ni las neuronas trigéminas se dispersan fácilmente, cada investigador tendrá que optimizar sus procedimientos de chapado. Si cultivas células de pulpa dental solas en pozos separados puedes usar inmunofluorescencia o puedes cuantificar los niveles de ARN o proteína para determinar cómo responden las células de pulpa dental a las neuronas. Recuerde blanquear cualquier recipiente o consejo que entre en contacto con el adenovirus.
Asegúrese de desechar las maquinillas de afeitar correctamente en un contenedor afilado.
