Nuestro protocolo proporciona un proceso claro para estudiar los efectos neuroconductuales de las sustancias y los contaminantes de interés en las larvas de pez cebra y para revelar la neurotoxicidad potencial de estos agentes. La técnica se puede realizar utilizando pruebas de alto rendimiento de neuroconductores en el modelo de pez cebra. Este método se puede aplicar para evaluar los efectos alelo-neuroconductuales de los contaminantes para demostrar la neurotoxicidad potencial en nosotros los seres humanos, ya que el genoma del pez cebra tiene una alta homología con los seres humanos, por lo que puede proporcionar indicaciones para la gestión química y los problemas de salud pública causados por los contaminantes.
Como el pez cebra tiene la ventaja de la detección de alto rendimiento, este método proporciona información sobre el desarrollo de drogas psicotrópicas y la investigación toxicológica ambiental. No te dejes intimidar por estudiar el primer experimento. Si sigue el protocolo, tendrá un resultado exitoso.
Al menos dos horas antes de realizar un experimento, ajuste la temperatura ambiente a 28 grados Centígrados y añada 800 microlitros de solución de exposición a cada pozo de una microplaca de 48 pocús. A continuación, utilice una pipeta de un mililitro con una punta modificada para transferir una larva en 200 microlitros de solución de exposición a cada pocótulo de la microplaca en preparación para un experimento de locomoción y ángulo de trayectoria. Para preparar una microplaca de seis pomos para experimentos de comportamiento social, agregue cuatro mililitros de solución de exposición a cada pozo de la microplaca de seis pozos y transfiera dos larvas en 200 microlitros de solución de exposición a cada pozo.
Antes de comenzar la prueba, abra el programa de software de supervisión de alto rendimiento y seleccione el módulo de ángulos de ruta de rotaciones de seguimiento. Transfiera la microplaca de 48 pocótelos a la plataforma de grabación y tire hacia abajo de la cubierta. Haga clic en Archivo y generar protocolo para comenzar a generar un nuevo protocolo e introduzca 48 en la posición de recuento de ubicaciones.
Haga clic en Parámetros, Parámetros de protocolo y Tiempo, establezca la duración del experimento en una hora y 10 minutos y el período de integración en 60 segundos. Usando la herramienta de forma elíptica, dibuje un círculo alrededor del pozo superior izquierdo. Seleccione el círculo y haga clic en Copiar, Marcar a la derecha superior, Pegar y Seleccionar.
Utilice el ratón para arrastrar el círculo copiado al pozo superior derecho y haga clic en Copiar, Marcar a la derecha superior, Pegar y Seleccionar de nuevo. A continuación, arrastre el círculo copiado al pozo inferior derecho y haga clic en Crear y borrar marcas. El sistema dibujará automáticamente un círculo sobre cada otro pozo de la placa.
A continuación, haga clic en Dibujar escala y dibuje una línea de calibración en la pantalla. Introduzca la longitud de la línea, establezca la unidad y haga clic en Aplicar al grupo. Establezca el color del animal en negro y establezca el umbral de detección en 16 a 18 para permitir la detección de los animales, ajuste el inactivo a una velocidad pequeña a 0,5 centímetros por segundo y el pequeño a gran velocidad a 2,5 centímetros por segundo.
Establezca las clases de ángulo de trazado de menos 180 a más 180 como se indica. Para establecer las condiciones de luz, haga clic en Parámetros, Conducción ligera, Utiliza uno de los 3 métodos de activación siguientes y Estímulos mejorados para establecer las condiciones de luz. Haga clic en Borde y establezca un período oscuro de 10 minutos, seguido de tres ciclos de períodos de luz y oscuridad de 10 minutos.
A continuación, guarde el protocolo. Cuando se hayan ajustado todos los parámetros, baje la iluminación en la sala de pruebas y permita que las larvas se aclimaten en el sistema durante 10 minutos. Al final del período de aclimatación, haga clic en Experimentar y ejecutar y cree la carpeta en la que se guardarán los archivos experimentales.
A continuación, escriba el nombre del resultado y haga clic en Fondo e inicio. Al final del experimento, haga clic en Experimentar y detener. A continuación, devuelva la microplaca de 48 pocillos a la incubadora de luz para experimentos posteriores.
Debido a que cada grupo puede incluir 16 animales, el sistema se puede utilizar para realizar pruebas de alto rendimiento de la locomoción y el ángulo de trayectoria bajo diferentes condiciones de tratamiento en una sola microplaca de 48 pocillos. La actividad social de las larvas se puede probar utilizando placas de seis pozos. En este experimento representativo, el grupo de mayor concentración de BDE-47 demostró una hipoactividad pronunciada durante el período oscuro, mientras que no se observaron cambios debidos a la exposición a BDE-47 durante los períodos de luz.
Además, el grupo de alta concentración de 6-hidroxi-BDE-47 realizó menos tiempos de rutina y promedio a los cinco días después de la fertilización. Sin embargo, se indujeron giros más sensibles en los grupos de exposición 6-metoxi-BDE47. La actividad social del pez cebra fue estimulada por la parafina clorada-70 y la parafina clorada de cadena corta-52b, mientras que la parafina clorada de cadena larga-52a acortó la duración del contacto de las larvas.
Es importante asegurarse de que las larvas transferidas para la prueba deben tener una capacidad de natación normal y no malformaciones. Otras variables, como la preferencia de color, la preferencia de oscuridad clara, toda la oscuridad, los movimientos de cola del pez cebra, se pueden incluir para responder preguntas adicionales sobre la toxicidad neuroconductual de los contaminantes ambientales. Las soluciones de exposición BDE-47 son neurotóxicas y tienen potencial de interrupción endocrina, así que asegúrese de evitar el contacto directo con la piel.
