El análisis de péptidos endógenos, que son más pequeños que la mayoría de las proteínas, pero más grandes que muchos péptidos digeridos es un campo poco examinado. Este protocolo aborda el scap en flujos de trabajo basados en espectrometría de masas. La espectrometría de masas es altamente sensible y se puede utilizar para atacar neuropéptidos específicos de interés o puede capturar y detectar una variedad de neuropéptidos dentro de una muestra.
La cuantificación y localización de la expresión de neuropéptidos por espectrometría de masas puede conducir al desarrollo de terapias peptídicas y al descubrimiento de biomarcadores de neuropéptidos para diversas enfermedades. Para comenzar la extracción de neuropéptidos, recolecte tejido cerebral del crustáceo y, utilizando fórceps, coloque inmediatamente un tejido cada uno en un tubo de 0,6 mililitros que contenga 20 microlitros de metanol acidificado. Añadir 150 microlitros de metanol acidificado a la muestra.
Establezca el tiempo total del paciente con Sonic en 24 segundos, el tiempo de pulso en ocho segundos. Pausa el tiempo a 15 segundos y la amplitud al 50% en un homogeneizador ultrasónico y homogeneiza las muestras en hielo. Centrifugar la muestra a cuatro grados Centígrados a 20.000 GS durante 20 minutos.
Con una pipeta se transfiere el sobrenadante a un tubo y se seca en un concentrador de vacío a aproximadamente 35 grados centígrados. Para la desalinización reconstituir la muestra de tejido extraída en 20 microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Vórtice la solución y sonice en un baño de agua a temperatura ambiente durante un minuto.
Aplique 0,5 microlitros de muestra a una tira de pH para confirmar que el pH es inferior a cuatro. Centrifugar a cuatro grados Centígrados y 20.000 GS durante 30 segundos. Preparar el lavado de equilibrio humectante en soluciones de ilusión.
Obtenga una punta desaladora de 10 microlitros con resina C18. Coloque la punta de desalinización en una pipeta de 20 microlitros que se ajuste a 15 microlitros. Aspire la punta tres veces con solución humectante y tres veces con solución de colaboración equi.
Aspirar en la muestra 10 veces seguido de lavar tres veces en solución de lavado desechando cada lavado. Elute aspirando 10 veces en cada una de las soluciones de ilusión con el fin de aumentar el acetonitrilo. Secar los neuropéptidos aludidos en un concentrador de vacío.
Reconstituir los neuropéptidos desalados secos en cinco microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Vórtice la solución y sonicarla en un baño de agua a temperatura ambiente durante un minuto. Centrifugación breve en 2000 GS. Para detectar neuropéptidos y tejidos de la corteza, pipetee una gota de muestra de tres microlitros en una película hidrofóbica.
Pipetee tres microlitros de matriz DHB directamente sobre la gota de muestra. Mezcle las soluciones canalizando hacia arriba y hacia abajo. Pipetear un microlitro de la mezcla de muestra y matriz en un pozo de la placa objetivo de acero inoxidable MALDI y usar la punta de la pipeta para extender cada mezcla a los bordes del pozo de muestra.
Detecte un microlitro de calibre uno a uno y mezcla de matriz en un pozo cerca de la muestra. Inserte la placa objetivo que contiene puntos de muestra secos en el instrumento de tiempo de vuelo en tándem MALDI. Con la matriz DHB, ajuste la potencia del láser al 95%, seleccione la ganancia óptima automática del detector y el modo inteligente de movimiento del portador de muestras completas.
Adquiera MS Spectra en el rango de 200 a 3, 200 M sobre Z y agregue múltiples espectros de cada punto juntos para aumentar la relación entre la señal del neuropéptido y el ruido. Llene media taza de criostato con gelatina y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Mantenga caliente la gelatina líquida sobrante en un baño de agua de 37 grados centígrados.
Recoja el tejido neuronal deseado del animal y use fórceps para sumergir inmediatamente el tejido en un tubo de 0,6 mililitros que contiene agua desionizada durante un segundo. Coloque el tejido sobre la gelatina sólida y llene el resto de la taza de criostato con gelatina líquida. Use fórceps para colocar el tejido.
Coloque la copa de criostato sobre una superficie plana y congele con hielo seco. Para la preparación de la sección, separe la muestra incrustada de gelatina del molde de criostato cortando el molde. Monte el tejido incrustado en un mandril de criostato pipeteando una gota de un mililitro de agua desionizada sobre el mandril e inmediatamente presionando el tejido incrustado sobre la gota.
Una vez congelada la pipeta, más agua desionizada alrededor del tejido para asegurarlo aún más al mandril. Seccionar el tejido a un grosor aproximado de una célula. Monte cada sección con el pulgar en un portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de indio y estaño colocando un lado de la diapositiva cerca de la sección y colocando un dedo en el otro lado de la diapositiva para calentar lentamente el vidrio y permitir que la sección se pegue a la diapositiva.
Exportar de Novo sólo péptidos. CSV de picos con un puntaje de confianza local promedio mayor o igual a 75. Busque en la lista de péptidos motivos de secuencia conocidos indicativos de neuropéptidos pertenecientes a familias específicas de neuropéptidos.
Elija una secuencia conocida de aminoácidos de la hormona pre-pro de interés y use TB blast N para buscar la secuencia de hormonas pre-pro de consulta en una base de datos. Seleccione el organismo objetivo y cambie los parámetros del algoritmo de umbral de espera a 1000 para incluir alineaciones de puntuación baja. Ejecute el programa blast y luego verifique los resultados para obtener puntajes de homología altos entre las secuencias de consulta y de sujeto que producen alineaciones significativas.
Guarde el archivo FASTA que contiene la secuencia de nucleótidos. Traduzca la secuencia de nucleótidos de la hormona pre-pro en secuencias de péptidos de la hormona pre-pro utilizando la herramienta de traducción Expasy. Para callinectes sapidus seleccione invertebrado mitocondrial para el código genético y ejecute la herramienta.
Verifique la secuencia del péptido de señal y los sitios de escisión de la hormona pro en las secuencias de péptidos utilizando la señal P.Este es un espectro de fragmentación de un neuropéptido identificado con una cobertura de secuencia del 100% en un error de masa de fragmento bajo con un límite máximo de 0.02 Dalton. Aquí hay un espectro de un neuropéptido también identificado con una cobertura de secuencia del 100%, pero con un bajo número de iones de fragmento, por lo tanto, la confianza de la identificación es baja. Estos son los cromatogramas iónicos extraídos para un solo neuropéptido que se identificó en dos tiradas separadas y consecutivas.
A pesar de que el tiempo de retención difiere ligeramente, esto todavía se puede utilizar para la cuantificación sin etiquetas porque el cambio de tiempo es inferior a un minuto. Este es un ejemplo de un espectro de masa de escaneo completo que contiene un neuropéptido que fue etiquetado con Dimetil, lo que resulta en un cambio de masa de Dalton de 4.025 entre las formas ligeras y pesadas del neuropéptido. El espectro de masa iónica de fragmentos de un péptido secuenciado De Novo demuestra una buena cobertura de fragmentación, donde se observó un ion fragmento B y/o Y para cada aminoácido con un error de masa bajo de 0,02 Dalton.
Esto indica que se observó un péptido endógeno perteneciente a la familia de neuropéptidos RYMI del crustáceo. Ejemplos de buenos puntos que tocan todos los bordes del pozo grabado se muestran a la izquierda. Y ejemplos de puntos malos se muestran a la derecha.
Después de la obtención de imágenes MALDI MS de neuropéptidos de tejidos callinectes sapidus, se obtuvieron imágenes de distribución iónica de varios valores de M sobre Z correspondientes a diferentes neuropéptidos. La optimización del disolvente de extracción para un tipo de analy en particular es crucial. También asegúrese de que se produzca una homogeneización completa y ajuste el método según sea necesario.
No se detectará nada aguas abajo si no se extrae. Esta técnica puede proporcionar una lista fundamental de neuropéptidos importantes que pueden investigarse más a fondo como biomarcadores potenciales, así como proporcionar información de localización no dirigida sin la necesidad de anticuerpos.
