La espectroscopia de fuerza de molécula única nos permite medir parámetros físicos que describen las propiedades mecánicas y adhesivas de los polímeros. Cuando se utiliza espectroscopia de fuerza basada en AFM para estudiar moléculas individuales, es esencial tener un protocolo confiable y eficiente para unir estas moléculas covalentemente a una punta voladizo AFM. Este protocolo se puede adoptar a muchos polímeros diferentes independientemente de la longitud del contorno o la hidrofobicidad.
Todos los pasos deben llevarse a cabo en una campana de humo para evitar la inhalación de vapores orgánicos. Además, se requiere vidrio resistente a disolventes, capa de laboratorio y protección ocular. Primero use pinzas recién limpiadas para colocar virutas en voladizo AFM en la cámara de plasma.
Inicie el programa de activación de la superficie de la cámara de plasma seleccionando inicio y luego sí. Compruebe que el proceso de plasma funciona correctamente. Un proceso de plasma con un alto contenido de oxígeno muestra un color azul claro.
Mientras se ejecuta el programa de activación de la superficie, disolver silane-PEG-mal en tolueno para obtener una concentración de 1,25 miligramos por mililitro. Coloque tres mililitros de la solución en un plato plano de Petri. Una vez completado el proceso de plasma, ventile la cámara de plasma seleccionando confirmar y luego ventilando.
Proceda inmediatamente al siguiente paso para evitar la absorción de contaminantes. Coloque las fichas en el plato Petri e incubar las fichas durante tres horas a 60 grados centígrados. Retire el plato Petri del horno y deje que se enfríe durante al menos 10 minutos.
A continuación, enjuague las fichas. Para la unión a PEG o poliestireno, enjuague las virutas con tolueno tres veces. Para la unión a polinipam, las virutas se deben enjuagar una vez con tolueno y dos veces con etanol.
Para reducir el impacto de las fuerzas capilares en el voladizo AFM, incline ligeramente las virutas al enjuagar. Las virutas en voladizo AFM deben enjuagarse correctamente para eliminar cualquier exceso de polímeros físicos que pueda influir en el experimento. El enjuague debe realizarse cuidadosamente para evitar cualquier daño a los voladizos AFM.
Por último, prepare al menos dos virutas para servir como controles que no serán objeto de fijación de polímero covalente. Para los controles frente a las virutas de PEG y poliestireno, enjuague dos veces con etanol y una vez con agua. Para los controles frente a las virutas de poliníptico, enjuague dos veces con agua.
Para realizar la unión covalente de PEG o poliestireno, preparar tres mililitros de solución polimérica en tolueno a una concentración de 1,25 miligramos por mililitro. Agregue la solución y las virutas a un plato de Petri e incubar las virutas a 60 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación con PEG o poliestireno, deje que las virutas se enfríen durante 10 minutos.
Enjuague las virutas dos veces con tolueno, dos veces con etanol y una vez con agua. Para realizar la unión covalente de polinipam, preparar tres mililitros de solución polimérica en etanol a una concentración de 1,25 miligramos por mililitro. Agregue la solución y las virutas a un plato de Petri e incubar las virutas a temperatura ambiente durante tres horas.
Después de la incubación con polinipam, enjuague las virutas dos veces con etanol y dos veces con agua. Para almacenar las virutas hasta que se usen en un experimento, coloque cada chip por separado en un plato petri de un mililitro lleno de agua. Mantenga los platos de Petri a cuatro grados centígrados.
En primer lugar, inserte el chip voladizo AFM funcionalizado en un soporte de viruta. Pegue la superficie preparada en un soporte de muestra adecuado para mediciones en líquido. Utilice una pipeta para sumergir el chip en agua.
Monte la superficie de la muestra en el AFM. Sumerja la superficie de la muestra en agua. Conecte el soporte de chip al AFM.
A continuación, acerque el chip a la superficie de la muestra. Utilice el panel ambiental para ajustar la temperatura objetivo y cambiar el modo y los botones de opción de retroalimentación. A continuación, deje que el sistema se equilibre durante unos 15 minutos.
Para tomar una curva de extensión de fuerza, acérquese a la punta volual AFM a la superficie y seleccione una sola fuerza. La curva resultante muestra la desviación contra la distancia piezoeléctrica con el acercamiento a la superficie mostrado en rojo y la retracción mostrada en azul. Expanda la parte de la curva que representa la sangría de la punta voladiza AFM en la superficie subyacente.
Para realizar un ajuste lineal, establezca los cursores en el enfoque o en la curva de retracción y seleccione actualizar INVOLS en el menú contextual. El valor resultante para el valor de sensibilidad de la palanca óptica inversa aparece en el panel en la parte superior izquierda. Después de repetir este procedimiento al menos cinco veces, calcule un promedio para la sensibilidad inversa de la palanca óptica e introduzca el promedio en el panel.
Coloque el voladizo AFM a una altura de aproximadamente 100 micrómetros por encima de la superficie seleccionando mover para preenganche. Para obtener una relación señal-ruido satisfactoria para el espectro de ruido térmico, establezca el recuento de promedio en al menos 10 y elija la resolución de frecuencia más alta posible. A continuación, registre el espectro de ruido térmico seleccionando capturar datos térmicos.
Para ajustar el espectro de ruido térmico con una función de oscilador armónico simple, expanda la parte de la curva que representa el primer pico de resonancia. A continuación, seleccione initialize fit. Por último, refinar el ajuste mediante el botón de ajustar datos térmicos.
La constante de fuerza respectiva aparecerá en el panel. Para comenzar a recopilar los datos, establezca los parámetros para el experimento. Ajuste la velocidad de tracción a un micrómetro por segundo y el gatillo de fuerza a un nanonewton.
Acérquese a la punta del voladizo AFM a la superficie y seleccione una sola fuerza para registrar una sola curva y determinar si los parámetros deben ajustarse como se describe en el manuscrito. Seleccione Mapa F en el panel maestro. Para obtener un mapa de fuerza con 100 curvas, establezca el número de puntos de fuerza y las líneas de fuerza en 10.
Comience a grabar el mapa de fuerza seleccionando hacer el mapa F. Tome curvas de extensión de fuerza de forma similar a una cuadrícula para evitar efectos de superficie locales y para promediar diferentes áreas de superficie. Después del experimento, repita la determinación de la sensibilidad inversa de la palanca óptica y la constante del muelle para comprobar la consistencia y la estabilidad del sistema.
Los polímeros de polinipam único y PEG se unieron covalentemente a una punta voladiza AFM en un extremo y se fisisorbieron en la superficie de dióxido de silicio en el otro extremo. Para medir el comportamiento de estiramiento dependiente de la temperatura, se identificó un evento de estiramiento claro de una sola molécula seguido de un máximo final al final de la curva de extensión de fuerza respectiva. A continuación, se generó una sola curva maestra para cada temperatura.
Para PEG, se observó una disminución de la fuerza de estiramiento con el aumento de la temperatura. Para el polinipam, se observó la tendencia opuesta. La desorción de poliestireno de una superficie SAM en agua se puede utilizar para determinar la fuerza y longitud de desorción.
Cuando el accesorio de polímero tuvo éxito, las curvas de extensión de fuerza mostraron mesetas de fuerza constante. Cada meseta estaba equipada con una curva sigmoideal para determinar la fuerza de desorción y la longitud de desorción. Las fuerzas de desorción observadas correspondían a valores obtenidos previamente.
Cuando se observó más de un polímero unido a la punta del voladizo AFM, se observaron cascadas de mesetas en las curvas de extensión de fuerza. Con dos polímeros unidos, se encontró una distribución bimodal para la longitud de desorción, mientras que la fuerza de desorción mostró una distribución estrecha. Una punta voladiza AFM funcionalizada se puede utilizar para cuantificar la respuesta de fuerza de moléculas individuales en un entorno líquido y con estímulos externos.
El uso de equipos limpios, disolventes, puntas en voladizo AFM y enjuague repetido es muy importante para alcanzar un alto nivel de limpieza que debe confirmarse antes de los experimentos controlados descritos. Los protocolos y procedimientos presentados allanaron el camino para una mejor comprensión de los sistemas de polímeros sensibles a los estímulos. Los resultados se pueden comparar directamente con las simulaciones dinámicas moleculares.
