Este protocolo describe la mejor manera de funcionalizar los voladizos AFM utilizando células T individuales y partículas sólidas. Estos consejos se pueden utilizar para sondear las interacciones de células T dendríticas de un solo par y para monitorear las respuestas celulares de tamaño voluble, respectivamente. Una de las principales ventajas de esta técnica es que utiliza un pegamento biocompatible para la funcionalización de células T individuales de voladizos.
Este pegamento es inerte a las células eucariotas, manteniendo así las células T en su etapa de activación basal. Estos métodos proporcionan información sobre la activación de las células inmunitarias y los eventos intercelulares complejos, como la formación de sinapsis inmune. Los métodos también se pueden extender a otros sistemas que implican interacciones de células celulares o celdas-superficie.
Para alguien que es nuevo en esta técnica, es importante asegurarse de que las células T están en buenas condiciones antes de su uso y que están pretratadas con IL-2 durante la noche. Además, cuando utilice el pegamento biocompatible, muévase rápidamente para protegerlo de la oxidación innecesaria. Para comenzar este procedimiento, prepare las células T únicas para la microscopía siguiendo el protocolo de texto.
Luego, prepare los cubreobjetos de vidrio sembrados con células DC2.4, e incubar las células durante la noche en una cámara humidificada a 37 grados Celsius y 5%CO2. Limpie los voladizos suaves y sin puntas con una constante de resorte bajo utilizando tratamiento de pirañas, limpieza por plasma o limpieza de ozono UV. A continuación, monte el voladizo limpio en el cabezal de escaneo AFM.
A continuación, prepare una cámara de muestra limpia y llénelo con agua pura. Calibrar el voladizo en la solución de agua ejecutando primero una curva de fuerza sobre el sustrato de vidrio para obtener la sensibilidad del voladizo. A continuación, registre un espectro de ruido térmico para extraer la constante del muelle.
Cuando el voladizo esté correctamente calibrado, retire el cabezal de escaneado AFM de la solución. Lave el voladizo montado con unas gotas de etanol puro, y mantenga el voladizo seco en el cabezal de escaneo. Precalienta un recinto de ambiente de celda viva a 37 grados Centígrados con 5%CO2.
A continuación, monte el cubreobjeto de vidrio sembrado con células DC2.4 en el conjunto de la cámara de muestra, e inmediatamente agregue 600 microlitros de Medio B a la cámara. Coloque el ensamblaje completado en la etapa de muestra de AFM. Agregue células T positivas CD4 incubadas por IL-2 humanas a la cámara de muestra.
Espere hasta que las células T de destino estén completamente asentadas en la parte inferior del cubreobjetos y, a continuación, lleve las células al campo de visión bajo el microscopio. Ahora, agregue una gota de dos microlitros de pegamento biocompatible en el extremo del voladizo montado con una pipeta. Una vez que el pegamento biocompatible se ha aplicado al voladizo, los pasos posteriores deben ser terminados tan pronto como sea posible con el fin de maximizar la adhesión.
Coloque rápidamente el cabezal de escaneado en la etapa de muestra, sumergiendo el voladizo recubierto de pegamento en la solución. Mueva la etapa de la muestra hasta que se encuentre una célula T de salud debajo de la punta del voladizo. A continuación, ajuste finamente su posición moviendo el cabezal de escaneado.
A continuación, baje el voladizo manualmente. Comience con un tamaño de paso de 50 micras, y luego disminuya a 10, cinco y dos y finalmente 0,5 micras gradualmente, como lo indica la nitidez de la imagen en voladizo. Ahora, mantenga la posición de los motores paso a paso y ajuste el posicionamiento del cabezal de escaneo para alinear mejor la punta del voladizo y la celda.
Continúe hasta que el contacto firme esté indicado por un pequeño desplazamiento de la posición del láser, correspondiente a una fuerza típica de 0,5 a 1,5 nanonewtons. Después de 30 segundos de contacto, retraiga el voladizo. Si la celda se mueve con el voladizo, el archivo adjunto se realizó correctamente.
Si no es así, repita la adhesión hasta tres veces antes de cambiar a un nuevo voladizo. Coloque la celda T conectada sobre una celda DC2.4 moviendo la etapa de la muestra y el cabezal de escaneo. Después de configurar los parámetros adecuados, ejecute la espectroscopia de fuerza sobre la muestra.
Para una nueva ronda de sondeo, monte un voladizo nuevo y limpio. Calibrarlo en agua pura, y luego volver a un par de células dendríticas de células T y repetir la exploración. Monte un cubreobjetos de vidrio limpio en el conjunto de la cámara de muestra.
En el lado izquierdo del cubreobjetos, agregue una gota de una solución de perlas que se ha diluido en etanol y contiene perlas de poliestireno de seis micras de diámetro. Una vez que el disolvente se evapora, compruebe el espaciado de las perlas utilizando un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo de 20x. Asegúrese de que las perlas individuales estén bien separadas.
A continuación, sumerja una punta de micropipeta o un palillo de dientes en un pegamento epoxi bien mezclado, y transfiera una pequeña cantidad de pegamento a tres puntos separados con sucesivos toques suaves en el lado derecho pero cerca del centro del cubreobjetos, como se muestra aquí. A continuación, monte un voladizo limpio y sin puntas en el cabezal de escaneo AFM y calibrarlo en aire con una superficie limpia para obtener la constante del muelle. A continuación, coloque la punta en voladizo sobre el límite izquierdo del último punto de pegamento epoxi, y lentamente traiga el voladizo cerca del pegamento utilizando pequeños tamaños de paso en los motores paso a paso.
Una vez que se ha hecho contacto con el pegamento, tire rápidamente del voladizo lateralmente moviendo la cabeza de escaneo AFM hacia atrás. Retire cualquier exceso de pegamento frotándolo contra el vidrio, dejando sólo una pequeña cantidad del pegamento en el extremo de la punta. Ahora, mueva la punta voladizo encima de un cordón bien aislado.
Acérquese a la cuenta única lentamente y haga un contacto firme con él en el rango de dos a cinco nanonewtons durante unos 10 segundos. Mientras hace contacto, utilice el ajuste de punta fina para colocar el cordón al final de la punta. Retirar la punta al final del contacto.
Si el cordón desaparece del plano focal original, se ha producido un evento de adhesión correcto. Por último, desmonte el voladizo modificado con el cordón con cuidado, y guárdelo en una caja en voladizo durante la noche para que el epoxi se cure completamente. Aquí están las curvas típicas de fuerza-distancia de la interacción de unión entre una sola celda T y una sola celda dendrítica en el transcurso de un ciclo de aproximación-retracción.
La curva roja clara es la curva de extensión, y la roja oscura es la curva de retracción. El valor mínimo en la curva proporciona una medida de la fuerza de adhesión máxima entre la celda T y la celda dendrítica, y el área debajo de la curva representa el trabajo necesario para separarlos. Los eventos de ruptura agudos y escalonados se pueden interpretar como ataduras de membrana que se extraen de la superficie de la célula debido a la fuerte unión en la interfaz de la célula y luego se rompen discretamente debajo de la tracción continua.
Aquí, la unión de células T convencionales a las células dendríticas se muestra en gris, y la unión de células T reguladoras a las células dendríticas se muestra en azul. Las fuerzas de adhesión entre una célula T convencional y una célula T reguladora reconocen los antígenos de péptidos presentados por las células que presentan antígenos, mientras que las células T reguladoras son células T supresoras que apagan la inmunidad mediada por células T convencionales hacia el final de una reacción inmunitaria. Este esquema de una celda RAW264.7 phagocítica con etiqueta fluorescente muestra que la célula se está acercando con un solo cordón de poliestireno desnudo de seis micras de diámetro.
Al enganchar el cordón, la membrana PIP2 se clasifica en el sitio de contacto, cerca de b, lo que luego induce el reclutamiento de membranas de moesina, lo que resulta en un evento fagocítico. Además del procedimiento descrito aquí, la espectroscopia de fuerza de una sola célula basada en AFM se puede utilizar junto con imágenes de fluorescencia para estudiar la activación de células inmunitarias en tiempo real a nivel de una sola célula. Técnicas combinadas de fluorescencia, este método permite abordar procesos celulares más complejos en tiempo real, como la formación de una sinapsis inmune entre la célula dendrítica y el par de células T.
