Más de un millón de uniformes de las gotas se producen en el sustrato del tamaño de un dedo. Y las moléculas de ADN individuales se distribuyen aleatoriamente en cada gota. El rendimiento proteico es proporcional al número de moléculas en una gota.
Nuestra técnica se puede utilizar para una medición rápida y cuantitativa de la actividad enzimática sin complicada expresión y purificación de proteínas. Para comenzar, coloque un vaso de cubierta en un estante de tinción y coloque el bastidor en ocho molares de hidróxido de sodio. Sonicar el vidrio de la cubierta y el estante de tinción durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Retire el estante antimanchas del hidróxido de sodio y enjuague el vaso de la cubierta con agua 10 veces. Seque el cristal de la cubierta con una pistola de aire. A continuación, hornee y seque el vaso de la cubierta en un plato caliente a 200 grados Celsius durante cinco minutos.
Preparar 0.05%aminosilano solución. Sumerja el cristal de la cubierta en esta solución e incubarlo durante una hora a temperatura ambiente. Enjuague el vaso de la cubierta cinco veces en agua pura.
A continuación, seque el cristal de la cubierta con una pistola de aire. Hornéalo en el plato caliente a 80 grados Celsius durante cinco minutos. Coloque el sustrato de vidrio de la cubierta en un portabrocas de vacío personalizado para la recubridora de espín.
Dispensar de 70 a 90 microlitros de polímero CYTOP tipo A en el centro del sustrato de vidrio. A continuación, inmediatamente spin-coat el polímero. El recubrimiento de polímero inicial daña la calidad de la matriz final de microcámaras.
Dispensar el polímero en el centro del vidrio de la cubierta sin introducir burbujas de aire. Recoja el vidrio recubierto sosteniéndolo en las esquinas y colóquelo en una lámina de aluminio. Hornee durante 30 minutos a 80 grados Celsius y luego durante otra hora a 200 grados Celsius.
Dispensar de 0,2 a 0,3 mililitros de fotorresistán en el centro del sustrato. Inmediatamente gire el fotorresistir a 6.000 rpm durante 60 segundos. Utilice una toallita empapada de etanol para eliminar el exceso de fotorresistir de los bordes del sustrato.
Hornee el sustrato a 110 grados Celsius durante cinco minutos. Para rehidratar el fotorresistir, deje reposar el sustrato durante 30 minutos a una humedad relativa de 42 a 60% Cargue el sustrato en el alineador de máscara y exponga durante 25 segundos en un modo de contacto al vacío. A continuación, sumerja el sustrato en el desarrollador durante cinco minutos para disolver el fotorresista expuesto.
Enjuague el sustrato 10 veces con agua pura. A continuación, seque bien el sustrato con la pistola de aire. Coloque el sustrato en la cámara de reacción de la máquina de grabado de iones reactivos y crone el CYTOP cubierto por fotorresistir con el plasma de oxígeno.
Después del grabado, retire el fotorresistir restante sonicando el sustrato en acetona durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, sonicar el sustrato en propanol durante cinco minutos. Enjuague, sonice y enjuague el sustrato de nuevo con agua pura como se describe en el manuscrito.
A continuación, seque el sustrato con una pistola de aire. Con un cortador de escritorio, corte la cinta de película Kapton adhesiva de doble recubrimiento en las formas de microcanal definidas. Pegue los trozos cortados de cinta en la parte inferior de un plato plano de Petri para servir como maestro para el moldeo del PDMS.
Vierta la mezcla PDMS en el plato Petri con patrón de cinta. A continuación, coloque el plato Petri en una mini cámara de vacío y desaerte la mezcla PDMS durante una o tres horas. A continuación, coloque el plato Petri en un horno a 60 grados Centígrados y déjelo durante la noche para curar el PDMS.
Una vez curado el PDMS, pele el elastómero curado de la placa Petri y utilice un cortador de cable plano para cortar los bloques de microcanal PDMS. A continuación, haga un agujero en cada extremo de cada microcanal. El sustrato previamente preparado tendrá un área para la matriz de microcámaras.
Coloque el microcanal PDMS en esta parte del sustrato. A continuación, inserte una punta de pipeta de 200 microlitros en uno de los orificios del microcanal PDMS. En primer lugar, prepare la solución de reacción CFPS en un tubo PCR.
A continuación, utilizando una punta de pipeta sin filtro de 200 microlitros, extraiga 10 microlitros de la solución. Inserte la punta de la tubería en el orificio de entrada del microcanal PDMS y empuje hacia abajo el émbolo de la tubería hasta que la solución se desborde de la salida del microcanal. Transfiera el dispositivo FemDA a un bloque de aluminio pre-refrigerado.
Confirme que el área de la matriz de microcámaras pasa rápidamente de translúcida a transparente. Extraiga 300 microlitros de aceite de descarga preenfriado e transfiera inmediatamente el aceite a la punta de la tubería del orificio de entrada del microcanal. El aceite al ras se mueve en el microcanal y extruye la solución de reacción excesiva situada fuera de las microcámaras.
Retire simultáneamente las dos puntas de pipeta insertadas del dispositivo. Mueva inmediatamente el dispositivo del bloque de aluminio a la película de parafina. Inserte la punta de la tubería preparada que contiene el aceite de sellado en la entrada del microcanal PDMS e inyecte el aceite hasta que se desborde de la salida.
Las gotas femtoliter están selladas en microcámaras individuales por el aceite. Abra la imagen BF desenfocada. Para eliminar fondos continuos suaves de cada fotograma, seleccione Restar fondo en el menú Proceso.
Introduzca 20 para el radio de bola rodante. Marque la casilla Vista previa y seleccione Aceptar. Seleccione Sí cuando se le pregunte si desea procesar todas las imágenes.
A continuación, para reducir el ruido, seleccione Proceso, Filtros, Mediana. Introduzca 2.0 para el radio en píxeles. Marque la casilla Vista previa y seleccione Aceptar.
Seleccione Sí cuando se le pregunte si desea procesar todas las imágenes. A continuación, seleccione Imagen, Ajustar, Umbral para separar las imágenes de las microcámaras del fondo de la imagen. En el menú Plugins, seleccione FemDA, FemDA Analysis.
Introduzca el número mínimo y máximo aproximado de píxeles de una sola microcámara. La circularidad mínima y máxima esperada de las microcámaras y los números de fotograma inicial y final, luego seleccione Generar ROI para detectar las microcámaras. Los ROI detectados correctamente se muestran en el menú emergente ROITable.
En la ventana Análisis de FemDA, seleccione Aplicar máscara de ROI. Examine la imagen para ver si las microcámaras se detectaron correctamente. Abra la imagen de fluorescencia y tráela al frente.
Haga clic en Aplicar máscara de ROI de nuevo para agregar los ROI a la imagen de fluorescencia. En la ventana Análisis de FemDA, seleccione One-Shot para analizar los datos de punto final de la imagen. Escriba N para el Número de píxeles superiores para utilizar los píxeles de gama superior de cada ROI para calcular la intensidad media de la gota correspondiente.
A continuación, haga clic en Medir intensidad para calcular las intensidades medias de todas las gotas detectadas. RoiTable se actualiza con los nuevos datos de la imagen de fluorescencia y el histograma se muestra en una nueva ventana. Exporte los datos haciendo clic en el botón Guardar como texto.
La solución fluorescente se encapsulaba en microcámaras FemDA y la intensidad de la fluorescencia, que está correlacionada con el tamaño de las gotas, se midió mediante microscopía. Se encontró que las gotas tenían una distribución de tamaño estrecho. La imagen 3D reconstruida a partir de la microscopía confocal también mostró el tamaño constante de las gotas a lo largo del tiempo.
Las gotas se estabilizaron a temperatura ambiente sin pérdida de evaporación o contaminación cruzada entre las gotas durante al menos 24 horas. La proteína fluorescente mNeonGreen fue sintetizada en FemDA. Y los datos de la imagen de pila se analizaron con la ayuda de la imagen de campo brillante desenfocada simultánea.
Debido a que la intensidad de fluorescencia de cada gota se mide de su rendimiento proteico, el histograma sugiere fuertemente un número desigual de moléculas de ADN por gota. La probabilidad de gotas que contienen diferentes números de moléculas de ADN era un ajuste perfecto a una distribución de Poisson. La síntesis de la enzima fosfatasa alcalina también se llevó a cabo en FemDA con imágenes capturadas cada cinco minutos.
La reacción mostró una distribución discreta similar de la intensidad de fluorescencia de las gotas en puntos de tiempo anteriores y los resultados del histograma verificaron que los números desiguales de las moléculas de ADN en las gotas. Una sola molécula de ADN encapsulada en gotas individuales se puede recuperar, amplificar y secuenciar aún más hacen que sea más alto el cribado de proteínas posible. Una técnica de gotas con volumen pequeño y alta estabilidad permite un diagnóstico molecular rápido y preciso de enfermedades cancerosas con biomarcadores específicos.
