물방울에서 100만 개 이상의 유니폼이 손가락 크기의 기판에서 생산됩니다. 그리고 단일 DNA 분자는 무작위로 각 물방울로 분포됩니다. 단백질 수율은 물방울에 있는 분자의 수에 비례합니다.
우리의 기술은 복잡한 단백질 발현 및 정제없이 효소 활성의 신속하고 정량적 측정을 위해 사용될 수 있습니다. 먼저 염색 선반에 커버 글래스를 놓고 랙을 8개의 어금니 나트륨 수산화나트륨에 놓습니다. 실온에서 커버 글래스와 스테인딩 랙을 15분 동안 초음파 처리합니다.
수산화 나트륨에서 염색 랙을 제거하고 물10 번 커버 유리를 헹구습니다. 에어 건으로 커버 글래스를 건조시십시오. 그런 다음 5 분간 섭씨 200도에서 핫 플레이트에 커버 글래스를 구워 서 건조시다.
0.05%의 아미노시란 용액을 준비하십시오. 이 용액에 커버 글래스를 담그고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 커버 글래스를 순수한 물에 5번 헹구습니다.
그런 다음 공기 총을 사용하여 커버 유리를 건조시십시오. 5분간 80도의 따뜻한 접시에 구워줍니다. 스핀 코터용 맞춤형 진공 척에 커버 글래스 기판을 놓습니다.
유리 기판의 중심에 타입-A CYTOP 폴리머의 70 에서 90 마이크로 리터를 분배합니다. 그런 다음 즉시 폴리머를 스핀 코팅합니다. 초기 폴리머 코팅은 최종 마이크로 챔버 어레이의 품질을 손상시다.
기포를 도입하지 않고 폴리머를 커버 글래스 의 중앙에 분배합니다. 코팅 된 유리를 모서리에 올려 놓고 알루미늄 호일에 놓습니다. 섭씨 80도에서 30분간 구운 다음 섭씨 200도에서 1시간 더 구워줍니다.
기판의 중앙에 있는 포토레지스트의 0.2 에서 0.3 밀리리터를 분배합니다. 600rpm에서 60초 동안 포토레지스트를 즉시 스핀 코팅합니다. 에탄올에 젖은 닦기를 사용하여 기판 가장자리에서 과도한 포토레지스트를 제거합니다.
기판을 섭씨 110도에서 5분간 굽습니다. 포토레지스트를 재수화하려면, 기판이 42~60%의 상대 습도에서 30분 동안 서게 하여 기판을 마스크 정렬기로 로드하고 진공 접촉 모드에서 25초 동안 노출시키십시오. 그런 다음 노출 된 포토 레지스트를 용해하기 위해 5 분 동안 개발자에게 기판을 침수하십시오.
순수한 물을 사용하여 기판을 10번 헹구는 다. 그런 다음 공기 총을 사용하여 기판을 철저히 건조시십시오. 반응성 이온 에칭 기계의 반응 챔버에 기판을 놓고 산소 플라즈마로 CYTOP를 덮은 포토 레지스트를 식히게 한다.
에칭 후, 실온에서 5 분 동안 아세톤에서 기판을 초음파 처리하여 나머지 포토 레지스트를 제거하십시오. 그런 다음 기판을 프로판올로 5분간 초음파 처리합니다. 원고에 설명된 대로 순수한 물을 사용하여 기판을 헹구고, 초음파 처리하고, 헹구십시오.
그런 다음 공기 총으로 기판을 건조시십시오. 데스크톱 커터를 사용하여 이중 코팅 된 점착형 Kapton 필름 테이프를 정의된 마이크로 채널 모양으로 잘라냅니다. PDMS의 성형마스터역할을 하기 위해 평평한 페트리 접시 바닥에 테이프를 붙인다.
테이프 패턴페트리 접시에 PDMS 혼합물을 붓습니다. 그런 다음 페트리 접시를 미니 진공 챔버에 넣고 PDMS 혼합물을 1~3시간 동안 분해합니다. 그런 다음 페트리 접시를 60도의 오븐에 넣고 PDMS를 치료하기 위해 하룻밤을 둡니다.
PDMS가 경화 된 후, 페트리 접시에서 경화 된 탄성탄을 벗기고 평면 케이블 커터를 사용하여 PDMS 마이크로 채널 블록을 잘라냅니다. 그런 다음 각 마이크로 채널의 각 끝에 구멍을 펀치. 이전에 준비된 기판은 마이크로 챔버 어레이에 대한 영역을 갖습니다.
PDMS 마이크로채널을 기판의 이 부분에 배치합니다. 그런 다음 PDMS 마이크로 채널의 구멍 중 하나에 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 삽입합니다. 먼저 PCR 튜브에서 CFPS 반응 용액을 준비합니다.
그런 다음 200 마이크로리터 비필터 파이펫 팁을 사용하여 용액의 10 마이크로리터를 그립니다. 파이펫 팁을 PDMS 마이크로채널의 입구 구멍에 삽입하고 마이크로채널 콘센트에서 솔루션이 오버플로될 때까지 파이펫 플런저를 아래로 밀어 넣습니다. FemDA 장치를 미리 냉각된 알루미늄 블록으로 전송합니다.
마이크로 챔버 어레이 영역이 반투명에서 투명으로 빠르게 변하는지 확인합니다. 미리 냉각된 플러시 오일 300마이크로리터를 끌어당기고 즉시 오일을 마이크로채널 입구 구멍의 파이프 팁으로 옮춥니다. 플러시 오일은 마이크로 채널로 이동하고 마이크로 챔버 외부에있는 과도한 반응 솔루션을 압출한다.
동시에 장치에서 삽입 된 두 개의 파이프 팁을 제거합니다. 즉시 알루미늄 블록에서 파라핀 필름으로 장치를 이동합니다. 밀봉 오일을 포함하는 준비된 파이펫 팁을 PDMS 마이크로채널입구에 삽입하고 콘센트에서 흘러들어볼 때까지 오일을 주입합니다.
펨토리터 물방울은 오일에 의해 개별 마이크로 챔버에 밀봉됩니다. 비집중 BF 이미지를 엽니다. 모든 프레임에서 매끄러운 연속 배경을 제거하려면 프로세스 메뉴에서 배경을 빼기를 선택합니다.
롤링 볼 반지름에 대해 20을 입력합니다. 미리 보기 란을 선택하고 확인을 선택합니다. 모든 이미지를 처리할지 여부를 묻는 질문에 예(예)를 선택합니다.
다음으로 노이즈를 줄이려면 프로세스, 필터, 중앙값을 선택합니다. 픽셀의 반지름에 대해 2.0을 입력합니다. 미리 보기 란을 선택하고 확인을 선택합니다.
모든 이미지를 처리할지 여부를 묻는 질문에 예(예)를 선택합니다. 다음으로 이미지, 조정, 임계값을 선택하여 미세 챔버의 이미지를 이미지 배경과 분리합니다. 플러그인 메뉴에서, 펨다, 펨DA 분석을 선택합니다.
단일 마이크로 챔버의 대략적인 최소 픽셀 및 최대 픽셀 수를 입력합니다. 마이크로 챔버와 시작 및 끝 프레임 번호의 예상 최소 및 최대 순환은 ROI 생성을 선택하여 마이크로 챔버를 감지합니다. 성공적으로 검색된 ROI는 팝업 메뉴 ROITable에 표시됩니다.
FemDA 분석 창에서 ROI 마스크 적용을 선택합니다. 이미지를 검사하여 미세 챔버가 제대로 감지되었는지 확인합니다. 형광 이미지를 열고 전면에 가져온다.
형광 이미지에 ROI를 추가하려면 ROI 마스크를 다시 적용하십시오. FemDA 분석 창에서 원샷을 선택하여 이미지 엔드포인트 데이터를 분석합니다. 상단 픽셀 수에 대해 N을 입력하여 각 ROI의 최상위 픽셀을 사용하여 해당 액적의 평균 강도를 계산합니다.
그런 다음 강도 측정을 클릭하여 감지된 모든 물방울의 평균 강도를 계산합니다. ROITable은 형광 이미지의 새 데이터로 업데이트되고 히스토그램이 새 창에 표시됩니다. 텍스트로 저장 버튼을 클릭하여 데이터를 내보냅니다.
형광용액은 FemDA 마이크로챔버에 캡슐화되었고 액적 크기와 상관관계가 있는 형광 강도는 현미경을 사용하여 측정되었다. 물방울은 크기 분포가 좁은 것으로 나타났습니다. 공초점 현미경 검사법에서 재구성 된 3D 이미지는 또한 시간이 지남에 따라 일관된 액적 크기를 보여 주었다.
물방울은 적어도 24 시간 동안 물방울 중 증발 손실 또는 교차 오염없이 실온에서 안정되었다. 형광 단백질 mNeonGreen은 FemDA에서 합성되었습니다. 그리고 스택 이미지 데이터는 동시 디포커스 밝은 필드 이미지의 도움으로 분석되었다.
각 액적의 형광 강도는 단백질 수율을 측정하기 때문에 히스토그램은 액적 당 DNA 분자의 불평등 한 수를 강력하게 시사합니다. DNA 분자의 다른 수를 포함하는 물방울의 확률은 푸아송 분포에 완벽한 적합이었습니다. 효소 알칼리성 인산염의 합성은 또한 5분마다 캡처된 이미지와 함께 FemDA에서 수행되었다.
반응은 이전 시점에서 물방울의 형광 강도의 유사한 신중한 분포를 보여주었고 히스토그램 결과는 물방울에 있는 DNA 분자의 불평등한 숫자가 있다는 것을 확인했습니다. 개별 물방울에 캡슐화된 단일 DNA 분자는 더 회복, 증폭 및 서열화되어 가장 높은 단백질 선별이 가능합니다. 소량과 높은 안정성을 특징으로 하는 액적 기술은 특정 바이오마커를 사용하여 암 질환의 신속하고 정확한 분자 진단을 가능하게 합니다.
