Более одного миллиона однородных из капель производятся на подложки размером с палец. И одиночные молекулы ДНК случайным образом распределены в каждую каплю. Урожайность белка пропорциональна количеству молекул в капле.
Наша методика может быть использована для быстрого и количественного измерения активности ферментов без сложной экспрессии и очищения белка. Для начала установите крышку стекла на окрашивание стойки и поместите стойку в восемь молярных гидроксида натрия. Sonicate крышка стекла и окрашивания стойки в течение 15 минут при комнатной температуре.
Снимите окрашивание стойки с гидроксида натрия и промойте крышку стекла водой 10 раз. Высушите крышку стеклом с помощью воздушного пистолета. Затем выпекать и высушить крышку стекла на горячей тарелке при температуре 200 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
Приготовьте 0,05%аминосилановый раствор. Погрузите крышку стекла в этот раствор и инкубировать его в течение одного часа при комнатной температуре. Промыть крышку стекла пять раз в чистой воде.
Затем высушите стекло крышки с помощью воздушного пистолета. Выпекать его на горячей тарелке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Поместите крышку стекла субстрата на индивидуальный вакуумный патрон для спина пальто.
Раздать от 70 до 90 микролитров полимера типа А ЦИТОП в центре стеклянного субстрата. Затем сразу же спин-покрытие полимера. Начальное полимерное покрытие повреждают качество конечного массива микрокамбер.
Разпределите полимер по центру крышки стекла без введения пузырьков воздуха. Возьмите стекло с покрытием, держа его по углам и поместите его на алюминиевую фольгу. Выпекать его в течение 30 минут при температуре 80 градусов по Цельсию, а затем еще на час при температуре 200 градусов по Цельсию.
Распределение от 0,2 до 0,3 миллилитров фоторезист в центре субстрата. Сразу же спин-пальто фоторезист при 6000 об/мин в течение 60 секунд. Используйте пропитанную этанолом салфетку, чтобы удалить избыток фоторезистаста с краев субстрата.
Выпекать субстрат при температуре 110 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Чтобы регидратировать фоторезист, пусть субстрат простоять 30 минут при относительной влажности от 42 до 60% загрузите субстрат в выравниватель маски и выставить его на 25 секунд в вакуум-контактном режиме. Затем погрузите субстрат в разработчика в течение пяти минут, чтобы растворить выставленную фоторезистку.
Промыть субстрат 10 раз с помощью чистой воды. Затем высушите субстрат с помощью воздушной пушки. Поместите субстрат в реакционной камере реактивно-ионной офортной машины и вытравлите фоторезист, покрытый ЦИТОП кислородной плазмой.
После травления, удалить оставшиеся фоторезист, sonicating субстрата в ацетон в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем sonicate субстрата в пропанол в течение пяти минут. Промыть, sonicate, и промыть субстрат снова с помощью чистой воды, как описано в рукописи.
Затем высушите субстрат воздушной пушкой. Используя резак для рабочего стола, вырежьте двухохвай клеевую пленку Kapton в определенные формы микроканал. Stick вырезать куски ленты в нижней части плоской чашки Петри, чтобы служить в качестве мастера для литья PDMS.
Налейте смесь PDMS в ленту узором Петри блюдо. Затем поместите чашку Петри в мини-вакуумную камеру и деаэратировать смесь PDMS в течение одного-трех часов. Затем поместите чашку Петри в духовку при температуре 60 градусов по Цельсию и оставьте его на ночь, чтобы вылечить PDMS.
После того, как PDMS вылечит, очистить вылечить еластомер из чашки Петри и использовать плоский кабель резак, чтобы вырезать блокы микроканал PDMS. Затем пробить отверстие на каждом конце каждого микроканал. Ранее подготовленный субстрат будет иметь область для массива микрокамбер.
Распоитите микроканал PDMS на этой части субстрата. Затем вставьте 200 микролитровый наконечник пипетки в одно из отверстий в микроканале PDMS. Во-первых, подготовить решение реакции CFPS в трубке ПЦР.
Затем, используя 200 микролитровых нефильтрованной наконечник пипетки, составить 10 микролитров раствора. Вставьте наконечник трубы в отверстие в входе микроканал PDMS и нажмите вниз на пипеточный поршень, пока раствор не выливается из розетки микроканал. Перенесите устройство FemDA в предварительно охлажденный алюминиевый блок.
Подтвердите, что область массива микрокамбер быстро превращается из полупрозрачной в прозрачную. Нарисуйте 300 микролитров предварительно охлажденного флеш-масла и немедленно перенесите масло в трубный кончик отверстия в входе в микроканал. Флеш-масло перемещается в микроканал и выдавливает раствор избыточной реакции, расположенный за пределами микрокамбер.
Одновременно удалите с устройства два вставленных наконечника пипетки. Немедленно перемести устройство из алюминиевого блока в парафиновую пленку. Вставьте подготовленный наконечник трубы, содержащий уплотняющий масло, в вход микроканал PDMS и ввишите масло, пока оно не выльется из розетки.
Капли фемтолитера запечатаны маслом в отдельных микрокамберах. Откройте дефокусированное изображение BF. Чтобы удалить гладкие непрерывные фоны из каждого кадра, выберите Subtract Background из меню Process.
Введите 20 для радиуса прокатки мяча. Проверьте окно предварительного просмотра и выберите Ok. Выберите Да, когда его спросили, следует ли обрабатывать все изображения.
Далее, чтобы уменьшить шум, выберите Процесс, Фильтры, Медиана. Введите 2.0 для радиуса в пикселях. Проверьте окно предварительного просмотра и выберите Ok.
Выберите Да, когда его спросили, следует ли обрабатывать все изображения. Далее выберите Изображение, Отрегулируйте, Порог, чтобы отделить изображения микрокамбер от фона изображения. Из меню Plugins выберите FemDA, FemDA Analysis.
Вввечаем приблизительный минимум и максимальное количество пикселей одной микрокамберы. Ожидаемая минимальная и максимальная круговая часть микрокамбер и числа кадров начала и конца, а затем выберите Roi Generate для обнаружения микрокамбер. Успешно обнаруженные ROIs отображаются во всплывающем меню ROITable.
В окне анализа FemDA выберите маску Apply ROI. Изучите изображение, чтобы увидеть, были ли микрокамберы должным образом обнаружены. Откройте флуоресценцию изображения и принести его на фронт.
Нажмите Примените маску ROI снова, чтобы добавить ROIs к изображению флуоресценции. В окне анализа FemDA выберите One-Shot для анализа данных конечных тока изображения. Введите N для числа верхних пикселей, чтобы использовать верхние пиксели каждой рентабельности инвестиций для расчета среднего интенсивности соответствующей капли.
Затем нажмите Измерение интенсивности для расчета среднего интенсивности всех обнаруженных капель. ROITable обновляется новыми данными с изображения флуоресценции, а гистограмма отображается в новом окне. Экспорт данных, нажав кнопку Сохранить как текст.
Флуоресцентный раствор инкапсулировался в микрокамберах FemDA, а интенсивность флуоресценции, которая коррелирует с размером капель, измерялась с помощью микроскопии. Было установлено, что капли имеют узкое распределение размеров. Реконструированное 3D-изображение из конфокаляной микроскопии также показало последовательный размер капли с течением времени.
Капли были стабильными при комнатной температуре без потери испарения или перекрестного загрязнения среди капель в течение по крайней мере 24 часов. Флуоресцентный белок mNeonGreen был синтезирован в FemDA. И данные изображения стека были проанализированы с помощью одновременного дефокусированного яркого изображения поля.
Поскольку интенсивность флуоресценции каждой капли измеряется ее урожайность белка, гистограмма настоятельно рекомендует неравное количество молекул ДНК на каплю. Вероятность капель, содержащих различные количества молекул ДНК, идеально подходила для распределения Пуассона. Синтез ферментной щелочной фосфатазы также проводился в FemDA с изображениями, сделанными каждые пять минут.
Реакция показала аналогичное сдержанное распределение интенсивности флуоресценции капель в более ранних точках времени, и результаты гистограммы подтвердили, что неравное количество молекул ДНК в каплях. Одноярусная молекула ДНК, инкапсулированная в отдельных каплях, может быть дополнительно восстановлена, усилена и секвенирована, что делает возможным скрининг на самые высокие белки. Техника капель с небольшим объемом и либо высокой стабильностью позволяет быстро и точно ставить молекулярную диагностику онкологических заболеваний с помощью конкретных биомаркеров.
