El protocolo permite la representación y el análisis no invasivos y de alta resolución de la función cardíaca del pez cebra adulto. Este método se puede utilizar para la validación de modelos de enfermedades cardíacas adultas y posibles análisis de drogas. Esta técnica permite un posicionamiento rápido de los peces para una imagen correcta proporcionando resultados precisos y reproducibles.
No es invasivo y se realiza bajo el agua lo que permite la rápida recuperación de los peces. Para configurar la plataforma para la adquisición de imágenes, utilice tijeras pequeñas o un bisturí para hacer una incisión en una esponja en la posición de las 12 en punto. Coloque la esponja en un recipiente de vidrio.
Con cinta adhesiva de doble cara, coloque el recipiente de vidrio que contiene la esponja en la plataforma de ultrasonido. Asegúrese de que el recipiente de vidrio esté en el centro de la plataforma y firmemente unido. Incline la plataforma hacia adelante unos 30 grados usando la perilla en el lado izquierdo del soporte de la plataforma.
Llene el recipiente de vidrio con aproximadamente 200 mililitros de agua del sistema de peces que contengan 0,2 miligramos por mililitro de metanesulfonato de ricaína. Inserte el transductor dentro del soporte del micromanipulador en la estación de tren de trabajo girando la muesca del transductor hacia el operador. Mantenga la matriz paralela al suelo con el lado de trabajo longitudinal con respecto a la etapa.
Deje suficiente espacio alrededor de 10 centímetros en ambos lados para que el sistema de rieles de transductor ahora conectado se mueva a lo largo de los ejes X e Y. Inicie sesión en el software de control y elija el ratón pequeño vascular. Crear un nuevo estudio, así como una nueva serie para cada animal inducido en el estudio.
Pulse el nuevo botón de estudio situado en la parte inferior izquierda de la pantalla en la página del navegador. La vista se inicia en modo B. Usando una red de peces, transfiera el pez a un pequeño tanque que contenga agua del sistema con 0,2 miligramos por mililitro de tricaína.
Espere hasta que el pescado esté completamente anestesiado sin movimiento o sin respuesta al tacto. Transfiera suavemente y rápidamente el pescado al recipiente de vidrio con la esponja en la incisión previamente hecha con el lado ventral del pez hacia arriba. Baje suavemente el transductor utilizando el mango del sistema de rieles colocándolo longitudinalmente y cierre el lado ventral del pez con la muesca del transductor orientadora al operador.
Deja de dos a tres milímetros de distancia de los peces. Ajuste la plataforma con respecto al transductor utilizando el micromaniprulador en los tres ejes hasta que se visualice el corazón del pez. Inmediatamente después de localizar el corazón, seleccione o permanezca en modo B y reduzca el campo haciendo zoom para lograr una mirada más cercana al corazón.
Si es necesario, mejore la calidad o el contraste de la imagen estableciendo el rango dinámico en 45 a 50 decibelios. Vaya a los controles de modo B en la opción más controles y, posteriormente, guarde el cambio en los ajustes preestablecidos de modo. Toque los ajustes preestablecidos de modo para seleccionar la configuración optimizada de adquisición de imágenes cada vez antes de empezar a crear una nueva serie.
Tome tantas imágenes como desee en el plano de eje largo. A continuación, cambie a Doppler de color para la detección y adquisición de flujo sanguíneo. Usando la pantalla táctil, coloque el cuadrante en la parte superior de la válvula auriculoventricular y localice la entrada que se distingue por la señal de color rojo.
Reduzca el área del cuadrante tanto como sea posible para aumentar la velocidad de fotogramas. Active la onda de pulso Doppler se mueve para muestrear la velocidad de entrada de sangre ventricular. Coloque la compuerta de volumen de la muestra en el centro de la válvula auriculoventricular para detectar la velocidad máxima de flujo.
La señal de color rojo se vuelve más amarillento. Ajuste el ángulo de onda de pulso en la pantalla con los dedos para que se alinee con la dirección de la entrada de sangre. Pulse start o update para comenzar a tomar muestras de la velocidad de la sangre que fluye hacia el ventrículo.
Determine la velocidad de salida colocando el cuadrante Doppler de color en la unión entre el ventrículo y el bulbo y localice el flujo. Esto se distingue por una señal de color azul. Coloque la compuerta de volumen de la muestra justo antes de la unión del bulbo del ventrículo y ajuste la línea de corrección del ángulo para que coincida con la dirección del flujo sanguíneo.
Ajuste la línea de base elevándola en el panel de velocidad de flujo para detectar y rastrear completamente los picos de señal. Tan pronto como se complete la adquisición de la imagen, utilice una cucharadita y transfiera el pescado al sistema regular aireado agua libre de tricaína y deje que el pescado se recupere. Para ayudar a la recuperación, chorro de agua repetidamente sobre las branquias utilizando una pipeta de transferencia para promover la aireación del agua y la transferencia de oxígeno.
Por lo general, toma de 30 segundos a dos minutos para reanudar el movimiento de las branquias y la natación. Abra el software de análisis de imágenes. Seleccione una imagen y haga clic en el icono de procesamiento de imágenes.
Ajuste el brillo y el contraste de la imagen para permitir una visualización clara de las paredes ventriculares o el patrón de flujo sanguíneo. Con la imagen de modo B, abra la lista desplegable desde la opción de eje largo parasternal en las mediciones del paquete cardíaco. Seleccione el rastreo del VL y trace la pared interna ventricular en la sistóla y la diástole para obtener el área ventricular en la sistóleo y la diastole y el volumen diastólico y el volumen sistólico final.
En este estudio, las imágenes en modo B permitieron el rastreo de la pared interna ventricular en la sistole y la diástole y la obtención de datos dimensionales como las dimensiones de la cámara y la pared. También se obtuvieron datos funcionales como frecuencia cardíaca, volumen de accidente cerebrovascular y salida cardíaca, así como parámetros de la función sistólica ventricular, incluyendo el cambio de área fraccionaria y la fracción de eyección. Las mediciones a nivel de la válvula auriculoventricular utilizando imágenes de modo Doppler de color también proporcionaron velocidades de entrada y salida de sangre ventriculares.
Basándose en la imagen Doppler de onda de pulso, se generó un valor de frecuencia cardíaca trazando tres picos de flujo aórtico consecutivos. Lo más importante es posicionar la plataforma de ultrasonido y el pez correctamente para obtener imágenes precisas y minimizar la exposición de los peces a la tricaína. Los métodos adicionales para apoyar este procedimiento incluyen el electrocardiograma de peces para la detección rápida de disfunción cardíaca como arritmias o métodos de histología para evaluar la estructura del tejido cardíaco o la muerte celular.
Estas técnicas permiten evaluar la función cardíaca del pez cebra y establecer un fenotipo cardíaco en modelos de enfermedades cardíacas de peces cebra. También permite probar nuevos fármacos, estudiar lesiones cardíacas y capacidad regenerativa. Tricaine MS-222 es un irritante de la piel, los ojos y las vías respiratorias.
Al preparar la solución de tricaína, el equipo de protección debe incluir una máscara antipolvo, protector para los ojos y guantes.
