O protocolo permite representação e análise não invasivas e de alta resolução da função cardíaca do zebrafish adulto. Este método pode ser usado para validação de modelos de doenças cardíacas adultas e potenciais telas de drogas. Esta técnica permite o posicionamento rápido do peixe para uma imagem correta, proporcionando resultados precisos e reprodutíveis.
Não é invasivo e realizado debaixo d'água que permite a rápida recuperação dos peixes. Para configurar a plataforma para aquisição de imagens, use uma tesoura pequena ou um bisturi para fazer uma incisão em uma esponja na posição das 12 horas. Coloque a esponja em um recipiente de vidro.
Usando fita dupla face, afixe o recipiente de vidro contendo a esponja na plataforma de ultrassom. Certifique-se de que o recipiente de vidro está no centro da plataforma e firmemente preso. Incline a plataforma para a frente cerca de 30 graus usando o botão no lado esquerdo do suporte da plataforma.
Encha o recipiente de vidro com aproximadamente 200 mililitros de água do sistema de peixe contendo 0,2 miligramas por mililitro tricaine metanosulfonato. Insira o transdutor dentro do suporte do micromanipulador na estação ferroviária de trabalho girando o entalhe do transdutor em direção ao operador. Mantenha a matriz paralela ao solo com o lado de trabalho longitudinal em relação ao palco.
Deixe espaço suficiente cerca de 10 centímetros em ambos os lados para o sistema ferroviário transdutor agora conectado se mover ao longo dos eixos x e y. Faça login no software de controle e escolha o mouse pequeno vascular. Crie um novo estudo, bem como uma nova série para cada animal induzido no estudo.
Pressione o novo botão de estudo localizado no lado inferior esquerdo da tela na página do navegador. A exibição começa no modo B. Usando uma rede de peixe, transfira o peixe para um pequeno tanque contendo água do sistema com 0,2 miligramas por mililitro de tricaine.
Aguarde até que o peixe esteja totalmente anestesiado sem movimento ou sem resposta ao toque. Transfira suave e rapidamente o peixe para o recipiente de vidro com a esponja para a incisão anteriormente feita com o lado ventral do peixe voltado para cima. Abaixe suavemente o transdutor usando a alça do sistema ferroviário colocando-o longitudinalmente e feche o lado ventral do peixe com o entalhe do transdutor voltado para o operador.
Deixe de dois a três milímetros de folga do peixe. Ajuste a plataforma em relação ao transdutor usando o micromanipulador nos três eixos até que o coração do peixe seja visualizado. Imediatamente após a localização do coração, selecione ou permaneça no modo B e reduza o campo ampliando para conseguir um olhar mais atento ao coração.
Se necessário, melhore a qualidade ou contraste da imagem, definindo o alcance dinâmico para 45 a 50 decibéis. Vá para os controles do modo B na opção mais controles e, posteriormente, salve a alteração para predefinições de modo. Toque em predefinições de modo para selecionar a configuração otimizada de aquisição de imagem todas as vezes antes de começar a imagem de uma nova série.
Pegue quantas imagens desejarem no plano do eixo longo. Em seguida, mude para doppler cor para detecção e aquisição de fluxo sanguíneo. Usando a tela sensível ao toque, posicione o quadrante em cima da válvula atrioventricular e localize o fluxo que se distingue pelo sinal de cor vermelha.
Reduza a área do quadrante o máximo possível para aumentar a taxa de quadros. Ative a onda de pulso que Doppler se move para amostrar a velocidade de entrada de sangue ventricular. Posicione o portão de volume da amostra no centro da válvula atrioventricular para detectar a velocidade máxima de fluxo.
O sinal de cor vermelha fica mais amarelado. Ajuste o ângulo de onda de pulso na tela usando os dedos para que ele se alinhe com a direção do fluxo sanguíneo. Pressione o início ou a atualização para começar a amostragem da velocidade do sangue que flui para o ventrículo.
Determine a velocidade de saída colocando o quadrante Doppler colorido na junção entre o ventrículo e o bulbo e localize o fluxo. Isso é distinguido por um sinal de cor azul. Posicione o portão de volume da amostra logo antes da junção do bulbo ventrículo e ajuste a linha de correção do ângulo para combinar com a direção do fluxo sanguíneo.
Ajuste a linha de base elevando-a no painel de velocidade de fluxo, a fim de detectar e rastrear completamente os picos de sinal. Assim que a aquisição da imagem estiver completa, use uma colher de chá e transfira o peixe para o sistema regular de água aerada livre de tricaine e deixe o peixe se recuperar. Para ajudar na recuperação, esguiche água repetidamente sobre as brânquias usando uma pipeta de transferência para promover a aeração da transferência de água e oxigênio.
Geralmente leva de 30 segundos a dois minutos para retomar o movimento da brânquia e a natação. Abra o software de análise de imagens. Selecione uma imagem e clique no ícone de processamento de imagem.
Ajuste o brilho e o contraste da imagem para permitir uma visualização clara das paredes ventriculares ou do padrão de fluxo sanguíneo. Usando a imagem do modo B, abra a lista suspensa a partir da opção de eixo longo parasténal nas medidas do pacote cardíaco. Selecione o traço de LV e trace a parede interna ventricular na sistóstole e na diastole para obter a área ventricular em sistósseo e diastole e volume diastólico e volume sistólico final.
Neste estudo, as imagens do modo B permitiram o rastreamento da parede interna ventricular em sístole e diastole e obtenção de dados dimensionais, como dimensões de câmara e parede. Também foram obtidos dados funcionais, como frequência cardíaca, volume de derrame e saída cardíaca, bem como parâmetros de função sistólica ventricular, incluindo alteração fracionária de área e fração de ejeção. As medições ao nível da válvula atrioventricular usando imagens do modo Doppler coloridas também forneceram velocidades de fluxo ventricular e fluxo sanguíneo.
Com base na imagem doPpler da onda de pulso, um valor de frequência cardíaca foi gerado traçando três picos de fluxo aórtico consecutivos. O mais importante é posicionar a plataforma de ultrassom e o peixe corretamente para imagens precisas e minimizar a exposição dos peixes à tricaine. Métodos adicionais para apoiar este procedimento incluem eletrocardiograma de peixe para detecção rápida de disfunção cardíaca como arritmias ou métodos de histologia para avaliar a estrutura do tecido cardíaco ou morte celular.
Essas técnicas permitem a avaliação da função cardíaca dos zebrafish e estabelecem um fenótipo cardíaco em modelos de doenças cardíacas de zebrafish. Também permite testar novas drogas, estudar lesões cardíacas e capacidade regenerativa. Tricaine MS-222 é uma pele, olho e irritante respiratório.
Ao preparar a solução tricaine, os equipamentos de proteção devem incluir uma máscara de poeira, escudo ocular e luvas.
