El ensayo de ligadura de proximidad permite a los usuarios detectar interacciones proteína-proteína in situ, revelando patrones espaciales y temporales de las interacciones. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas importantes sobre la regulación del desarrollo de C.elegans. Esta técnica ofrece una sensibilidad comparable para la detección de interacciones proteína-proteína sin la complejidad de otras técnicas, como FRET y BiFC.
Individuos que nunca han diseccionado gusanos para liberar las gónadas pueden luchar con este paso. Practique gusanos diseccionados y utilícelos para la inmunofluorescencia para perfeccionar las técnicas de manipulación y disección antes de pasar al PLA. Para empezar, escoge de 30 a 40 gusanos adultos jóvenes en un plato de cristal de reloj que contenga 500 microlitros de 1x M9 y levamisol.
Después de recoger los gusanos, retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos. Añadir 500 microlitros frescos de 1x M9 y levamisol, y utilizar la pipeta para extraer y dispensar suavemente el medio para enjuagar los gusanos. Retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios.
Repita el lavado de dos a tres veces. Después de los lavados, deje los gusanos en unos 100 microlitros de medios durante no más de ocho minutos. Usando una pipeta de vidrio o polietileno, transfiera los gusanos a un portaobjetos de microscopio de 25 milímetros por 75 milímetros recubierto con 001%poli-L-lisina.
Retire el exceso de medios para que permanezcan aproximadamente 15 microlitros de medios en la diapositiva. La eliminación del exceso de búfer es fundamental para garantizar que los gusanos diseccionados y las gónadas se adhieran a la diapositiva. Bajo un microscopio de disección, con dos agujas de calibre 26 de 1/2, coloque una aguja sobre la otra para que los extremos formen un par de tijeras.
Usando las agujas orientadas de esta manera, cortar los gusanos detrás de la faringe para liberar las líneas germinales. Disecciona todos los gusanos en cinco minutos. Después de diseccionar todos los gusanos, coloque suavemente un cubreobjetos de 22 milímetros por 40 milímetros sobre la diapositiva para que sea perpendicular a la diapositiva.
Los extremos del cubreobjetos deben colgarse de la corredera. Congele los portaobjetos en un bloque de aluminio pre-refrigerado mantenido sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Coloque suavemente un lápiz frío en la parte superior del cubreobjetos para evitar que el cubreobjeto se afloje debido a la expansión del hielo.
Cuando esté listo para la fijación, deslice los cubreobjetos con un lápiz e inmediatamente sumerja la diapositiva en un frasco que contenga metanol fresco y helado durante un minuto. A continuación, limpie suavemente los bordes de la diapositiva que rodea la muestra y aplique 150 microlitros de fijador de formaldehído a temperatura ambiente para fijar durante cinco minutos. Toque la diapositiva en una toalla de papel en un ángulo perpendicular de 90 grados para dejar que el fijador se salga de la diapositiva y absorberlo en la toalla de papel.
Bloquee los portaobjetos dos veces durante 15 minutos a temperatura ambiente en un frasco de Coplin con 50 mililitros de PBT/BSA. A continuación, bloquee los portaobjetos con una solución PBT/BSA que contenga un 10% de suero de cabra normal. Limpie suavemente los bordes que rodean la diapositiva y aplique 100 microlitros de la solución a cada diapositiva.
Y agitar suavemente la diapositiva para ayudar a extender la solución. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que la solución se escale y limpie suavemente los bordes.
Para bloquear las diapositivas, aplique una gota del reactivo de bloqueo al espacio de 14 milímetros por 14 milímetros. Incubar los toboganes durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. Coloque las diapositivas en una toalla de papel para dejar que el reactivo de bloqueo salga corriendo de la diapositiva y limpie suavemente los bordes.
Utilice el diluyente de anticuerpos para diluir los anticuerpos primarios. Aplique 40 microlitros de la solución de anticuerpos primarios diluidos por espacio de 14 por 14 milímetros en las diapositivas. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.
Por la mañana, lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos, cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital establecido en 60 rpm. Coloque las diapositivas en una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escalda de la diapositiva y limpie suavemente los bordes.
Prepare una solución de 40 microlitros que contenga sondas más y menos. Agregue la solución a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incubar los toboganes en una cámara húmeda durante una hora a 37 grados centígrados.
Lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital establecido en 60 rpm. Diluir el buffer de ligadura uno a cinco con agua ultrapura.
Utilice este búfer para diluir la ligasa de uno a 40 para preparar un stock de trabajo de solución de ligadura. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se salga de los lados y limpie suavemente los bordes. Agregue 40 microlitros de la solución de ligadura a cada espacio de 14 por 14 milímetros.
Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de lavar y secar los portaobjetos como se describió anteriormente, agregue 40 microlitros de solución de amplificación recién preparada, protegidos de la luz, a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incubar los toboganes en la cámara húmeda y oscura durante una hora y 40 minutos a 37 grados centígrados.
Lave los portaobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno con 50 mililitros de tampón de lavado B, y lave las diapositivas una vez durante un minuto con 50 mililitros de tampón de lavado 01x B.Después de secar el perímetro recubierto de epoxi de la corredera, agregue 10 microlitros de montaje medio a cada muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior, lo que permite que el medio de montaje se extienda. Pinta alrededor del borde del cubreobjetos con esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos y deslizarlo. Evite mover las cubiertas.
Deje que el esmalte de uñas se endurezca durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. La co-inmunostaining de las líneas germinales con anticuerpos FLAG y GFP reveló su patrón de expresión en la línea germinal. Mientras que la GFP se expresaba a lo largo de la línea germinal, la expresión OMA-1:GFP se limitaba al paquiteno tardío y a los ovocitos.
La inmunostaining FLAG muestra que 3xFLAG:DLC-1 se expresó a través de la línea germinal en ambas cepas. La región de interés para la cuantificación del PLA en la línea germinal abarcó el paquiteno tardío a través de los ovocitos en todas las líneas germinales. Esta es la región de la expresión OMA-1.
3xFLAG:DLC-1, OMA-1:Las líneas germinales GFP parecían tener una mayor cantidad de focos PLA dentro de esta región en comparación con las líneas germinales 3xFLAG:DLC-1, GFP. Asegúrese de que haya suficiente agua para elevar la humedad en la cámara. Además, asegúrese de que los portaobjetos estén nivelados dentro de la cámara para evitar la escorrentía de reactivos.
Tras el ensayo de ligadura de proximidad, las gónadas extruidas se pueden ver en un microscopio confocal y cuantificarse utilizando el flujo de trabajo de Fiji, ImageJ. Esta cuantificación puede ayudar a determinar si la interacción es estadísticamente significativa. PLA nos permitió evaluar las interacciones in situ entre los reguladores críticos del desarrollo de la línea germinal de los nematodos.
