The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

1. Preparación de bacterias Alimentación NOTA: En esta sección se describe la preparación de las bacterias se alimentan (E. coli cepa OP50). <ol><li> Aislar una sola colonia de E. coli cepa OP50 de un caldo de lysogeny (LB) placa de agar y asépticamente inocular en 300 ml de caldo LB en autoclave. </li><li> Permitir que el cultivo inoculado para crecer durante la noche en un agitador a 200 rpm y 37 ° C, hasta que se alcanza la saturación. </li><li> Transferir el OP50 en 6 tubos de 50 ml estériles, previamente pesado cónicas. Sedimentar las bacterias por centrifugación durante 5 min a 6000 rpm (5000 xg). </li><li> Descartar el sobrenadante y lavar las bacterias con 50 ml de estéril M9. Repetir dos veces. </li><li> Después del segundo lavado quitar el restante M9, asegurando que no M9 se deja en el tubo. </li><li> Determinar el peso de la pastilla pesando el tubo que contiene el sedimento de bacterias y restar el peso del tubo cónico de 50 ml. </li><li> Resuspender el pellet in M9 a una concentración de 100 mg / ml. </li><li> Almacenar la solución OP50 a 4 ° C hasta que se utiliza para el cultivo gusano. </li></ol> 2. Preparación de crecimiento Nematodo Mediano Placas (NGM) Petri NOTA: En esta sección se describe la preparación de placas NGM Petri, que son las placas donde el C. gusanos elegans se mantienen rutinariamente en el laboratorio. <ol><li> Autoclave el medio de agar NGM. </li><li> Usando procedimientos estériles, dispensar 17 ml de solución de agar NGM en 6 cm placas de Petri utilizando una bomba peristáltica. NOTA: Una cantidad constante de agar en las placas reduce la necesidad de reorientar el microscopio cuando se pasa de una placa a otra. </li><li> Deje las placas a temperatura ambiente durante 2-3 días antes de su uso para que el agar se solidifique y permitir que el exceso de humedad se evapore. </li><li> Sembrar las placas NGM utilizando una técnica estéril. Aplicar 1-2 gotas de cultivo líquido OP50 y extender con una varilla de vidrio. Asegúrese de que nopara difundir el césped bacterias todo el camino hasta los bordes de las placas. </li><li> Permitir que el césped OP50 crecer durante 1-2 días a temperatura ambiente antes de usar las placas de crecer gusanos. </li></ol> 3. Preparación de un gusano síncrono Población NOTA: El ciclo de vida de C. elegans se compone de la etapa embrionaria, cuatro estadios larvarios (L1-L4) y la edad adulta. En esta sección se describe la preparación de una población en edad sincrónica de gusanos. Todos los materiales que entran en contacto con C.elegans después del tratamiento blanqueador deben ser estériles. <ol><li> Día 1 - Preparación de Gravid Gusano Población <ol><li> Utilice NGM placas en el que la mayoría de la población de larvas de gusano consiste L1 Starved. </li><li> Recoge las larvas L1 con un gusano esterilizada recoger y transferirlos a 6 cm NGM placas frescas sembradas con OP50. Incubar durante aproximadamente 65 horas a 20 ° C hasta que la mayoría de los gusanos son adultos grávidas. Aevitar placa de hacinamiento y permitir que los gusanos crezcan sin agotar las bacterias, no transferir más de uno o dos grupos de larvas L1 a cada placa NGM fresco. </li></ol></li><li> Día 4 - Establecimiento de un Sincronizado L1 larvas Población <ol><li> Recoger los gusanos grávidas de las placas NGM lavándolas con 1-2 ml de M9 y transferirlos a un tubo de 15 ml cónico. </li><li> Deje que los gusanos grávidas de sedimentos para la parte inferior del tubo cónico de 15 ml durante aproximadamente 5-10 min. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento gusano. </li><li> Transferir el pellet gusano para 2-4 tubos de microcentrífuga y añadir 1 ml de lejía / solución de NaOH. Incubar durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. Monitorear el progreso de la reacción bajo el microscopio estereoscópico para confirmar todos los gusanos están muertos. No blanquear más de 5 min como los embriones podrían morir. </li><li> Recoger los gusanos por centrifugación durante 1 min a 3000 rpm (900 xg). Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de estéril M9neutralizar la reacción. </li><li> Lavar los gusanos dos veces por centrifugación durante 1 min a 3000 rpm (900 xg). </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir M9 a un máximo de 100 a 200 l. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio añadir una gota de gusano / M9 mezclar para despejar NGM placas e incubar durante al menos 24 horas a 20 ° C para permitir que los embriones eclosionan. NOTA: Sin comida crecimiento de las larvas se detendrá en la fase L1. </li></ol></li><li> Día 5 - Establecimiento de un Sincronizado L4 larvas Población <ol><li> Recoger las larvas L1 de las placas de NGM claras por lavado de las placas con 1-2 ml de M9 y transferirlos a un tubo de 15 ml cónico. </li><li> Deja que los muertos gusanos adultos sedimento al fondo del tubo cónico de 15 ml durante aproximadamente 5 min. </li><li> Recoger el sobrenadante, donde los gusanos L1 son, en un nuevo tubo cónico de 15 ml, y precipitar los gusanos mediante centrifugación durante 2 min a 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Eliminar el sobrenadante leabiendo aproximadamente 500 l. </li><li> Determinar la concentración de gusanos en la solución M9 contando el número de gusanos en 10 l gotas usando un estereomicroscopio. Contar al menos 5 gotas. </li><li> Ajustar la concentración de los gusanos a 20-25 gusanos / l y añadir 50 l de gusano / mezcla M9 a NGM placas sembradas con OP50. </li><li> Incubar durante 65 horas a 15 ° C (para la incubación a través del fin de semana) para permitir que la población sincronizada L1 a crecer hasta llegar a la etapa L4. </li></ol></li></ol> 4. La exposición de los gusanos a los productos químicos en las placas de 96 pocillos NOTA: En esta sección se describe el uso de Pxol1 :: transcripcional reportero gfp contiene C. elegans cepa para la detección de la inducción de aneuploidía. <ol><li> Recoger las larvas L4 de las placas de NGM claras por lavado de las placas con 1-2 ml de M9 y transferirlos a un tubo de 15 ml cónico. </li><li> Deje que el L4 gusanos de sedimentos a la parte inferior de la15 ml tubo cónico de aproximadamente 5-10 min. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento gusano. </li><li> Añadir 3-5 ml de M9 y determinar la concentración de gusanos en la solución M9 contando el número de gusanos en 10 l gotas usando un estereomicroscopio. Contar al menos 5 gotas para cada muestra. </li><li> Resuspender los gusanos a una concentración de 1,000 gusanos / ml en M9. </li><li> Diluir las bacterias OP50 de la sección 1 de 10 veces con M9. Asegúrese de que las bacterias se resuspendieron alcancen la temperatura ambiente ya temperatura más baja afecta el desarrollo del gusano. </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de primero el gusano / mezcla M9 (del paso 4.4) y luego añadir 400 l de las bacterias OP50 diluidas (del paso 4.5) a cada pocillo de una 2 ml de profundidad ronda placa de 96 pocillos de fondo. Al final, cada pozo tendrá 100 gusanos en 500 l. </li><li> Añadir 0,5 l de cualquiera de la sustancia de ensayo o el control apropiado a los pocillos deseados, para lograr un concentr definitiva sugeridoación de 100 mM, una concentración comúnmente usado en pantallas químicos en C. elegans 12. Exponer etanol o controles de disolvente DMSO a una concentración final de 0,1%. NOTA: Se recomienda el uso de nocodazole (100 M) como control positivo. </li><li> Sellar la placa con película adhesiva. Asegúrese de sellar la placa bien para prevenir la contaminación cruzada entre los pozos. </li><li> Envuelva el plato con papel de aluminio. </li><li> Transferencia de la placa a un agitador (170-180 rpm) de la temperatura apropiada para la longitud de tiempo adecuado (24 o 65 hr). La temperatura de la habitación afecta el crecimiento de los gusanos; mantener la temperatura alrededor de 20 ° C. </li></ol> 5. Adquisición de imágenes de grávidas gusanos en una placa de 384 pocillos NOTA: Esta sección describe el uso de un microscopio de alta contenido a la imagen de la Pxol1 expuesta :: gfp gusanos, para visualizar la expresión de GFP en los embriones dentro del útero de adultos hermafroditas. Paracada placa de 384 pozos que se proyectarán, usar gusanos de placas de 4 x 96 pocillos. <ol><li> Después de la exposición química en el agitador, dejar que el resto de 96 pocillos placa durante 10-15 minutos para permitir que los gusanos adultos se sedimenten en el fondo de la placa. </li><li> Con una pipeta multicanal, eliminar 350 l de la M9, ​​teniendo mucho cuidado de no molestar a los gusanos en la parte inferior de la placa. </li><li> Lave los gusanos con 1 ml de M9 y repita el paso 5.1. </li><li> Con una pipeta multicanal, quite 1 ml de la M9, ​​siendo vey cuidado de no molestar a los gusanos en la parte inferior de la placa. </li><li> Con una pipeta multicanal, volver a suspender las lombrices en el restante M9 y recoger 100 l de gusano / mezcla M9 de las placas de 96 pocillos y cargarlo en los pocillos de una paredes negras / placa de 384 pocillos con fondo claro. Repita el proceso utilizando gusanos de placas de 4 x 96 pozos, hasta que se hayan cargado todos los pocillos de la placa de 384 pocillos. NOTA: Es importante que todos los pozos que tienen el mismo volumen con el fin de aumentar lala eficiencia y la velocidad del enfoque automático durante el proceso de adquisición de la imagen. Cada pocillo debe contener entre 80 y 100 gusanos. </li><li> Añadir 1 l de levamisol (100 M) a cada pocillo y dejar que los gusanos se incuban durante aproximadamente 30 min. NOTA: El levamisol actúa como un agonista del receptor de acetilcolina e inmoviliza los gusanos. </li><li> Transferir la placa a un alto contenido microscopio de campo amplio capaz de proporcionar imágenes automatizado. </li><li> Para la adquisición de imágenes, usar un alto adquisición y análisis de imágenes de software de contenido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Seleccione el objetivo de 4X para adquirir 1 imagen por pocillo. </li><li> Antes de iniciar la adquisición de la imagen, ajustar los parámetros de imagen GFP a 45 ms de la exposición y resolución de imagen de 2160 x 2160. </li><li> Recoger los datos como el número de gusanos GFP positivos dividido por el número total de gusanos en el pozo, esta última medida es relativamente constante entre los pozos. </li></ol>

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	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

El método descrito aquí constituye la primera estrategia de gran escala para la identificación de sustancias tóxicas de la línea germinal. Se requiere el uso de un transgénico GFP Pxol-1 :: GFP que contiene la cepa que reporta fielmente la inducción de aneuploidía en embriones tempranos que se utiliza como proxy para la disfunción de la línea germinal. El método implica la sincronización cuidadosa de una C. población de gusanos elegans y la exposición a los productos químicos gu...

Hay aproximadamente 87.000 productos químicos registrados para el comercio en los Estados Unidos, sin embargo, sólo un pequeño número de ellos han sido probados para potenciales efectos sobre la salud 1. De los que han sido probados, sólo una parte se ha evaluado para los efectos de salud reproductiva debido en parte a la dificultad en la determinación de la alteración de los primeros eventos reproductivos en mamíferos, especialmente durante el desarrollo de células germinales femeninas y la diferenciación. De hecho, los primeros eventos meióticos tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario en mamíferos hembras y son, por tanto, de difícil acceso y recoger en números adecuados para fines de selección. La línea germinal proporciona el vínculo crucial entre las generaciones, y su función apropiada depende de la precisa ejecución del programa intrincado de la división celular y cromosómica denomina meiosis. La disregulación del proceso de meiótica puede resultar en la reducción de la fertilidad y la producción degametos y embriones con un número anormal de cromosomas, una condición denominada aneuploidía. Errores de segregación de cromosomas en la meiosis son muy importantes para la salud humana. Las anomalías cromosómicas son comunes, con una frecuencia de 1 de cada 150 nacidos vivos, la trisomía 21, 18 y 13, así como X e Y los errores cromosómicos son los tipos más frecuentes 2,3. Por otra parte, las malformaciones congénitas, incluidas las de origen cromosómico, son la principal causa de muerte infantil en los EE.UU. 4 La idea de que las influencias ambientales pueden afectar la segregación cromosómica y el comportamiento no es nuevo 5, pero aún es poco conocido. Por tanto, es fundamental investigar cuál de los productos químicos introducidos en nuestro entorno están interfiriendo con la fertilidad humana, el desarrollo temprano y la salud reproductiva en general. A la luz de estas limitaciones de los modelos de mamíferos, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento pantalla para probar la toxicidad reproductiva en la lombriz &lt;em&gt; C. elegans. Hemos movilizado a varias características importantes que ofrece este sistema modelo genético de uso común, como su pequeño tamaño, bajo coste, ciclo de reproducción corto, alta proporción de células germinales y la facilidad de manipulación 6. Los gusanos pueden ser cultivadas en placas de 96 pocillos o en cultivos líquidos de alto volumen y por su transparencia se pueden visualizar directamente en placas para la detección de los reporteros fluorescentes. El ensayo descrito a continuación se aprovecha de estas características y se aprovecha de una cepa de gusano que contiene el indicador fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar la interrupción de la línea germinal y la inducción de aneuploidía embrionario. El uso de esta cepa reportero se basa generalmente en la rara aparición de machos en una población de gusanos principalmente hermafrodita. Estos machos (&lt;0,2%) se originan naturalmente de error en la segregación del cromosoma X 7. Sin embargo, como la interrupción de la línea germinal conduce con frecuencia a errores en la segregación de los autosomasy de heterocromosomas, que se correlaciona tanto con una incidencia elevada de machos fenotipo (X missegregation), así como la letalidad embrionaria (missegregation autosoma). Para detectar fácilmente la inducción de hombres, mientras que eludir el problema de la letalidad embrionaria, un promotor específico masculino (Xol-1) se utiliza para conducir la expresión de GFP en embriones tempranos todavía contenidos dentro del útero de la gusano. Como tal, la aparición de embriones que expresan GFP se utiliza como un indicador de la presencia de embriones aneuploides. Este método ha sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados en el mantenimiento de la línea germinal y 8,9 meiosis. Adaptado a la detección química, esta cepa se emplea en un medio de pantalla de alto rendimiento. Es importante destacar que la cepa informa fielmente el aneugenicidad de productos químicos y es, por tanto, relevante para puntos finales reproductivos de mamíferos 10. El ensayo descrito aquí será particularmente útil para toxicólogos en entornos de la industria farmacéutica y química que buscanpara evaluar rápidamente la toxicidad de los productos químicos hacia los puntos finales reproductivos. Por otra parte, este ensayo se alinea plenamente con las prioridades gubernamentales destacadas en la toxicidad en el 21 informe 11 del siglo XXI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

La identificación de la toxicidad para la reproducción de los miles de productos químicos presentes en el medio ambiente ha sido uno de los retos más tentadoras en el campo de la salud ambiental. Esto se debe en parte a la escasez de sistemas de modelos que pueden (1) recapitular precisión claves características de los procesos reproductivos y (2) lo hacen de una a medio y forma de alto rendimiento, sin la necesidad de un alto número de animales vertebrados. Se describe aquí un ensayo en el nematodo C. elegans que permite la rápida identificación de sustancias tóxicas de la línea germinal mediante el control de la inducción de embriones aneuploides. Al hacer uso de una línea reportero GFP, los errores en la segregación cromosómica resultante de la interrupción de la línea germinal son fácilmente visualizaron y cuantificaron por microscopía de fluorescencia automatizado. Así, la proyección de un conjunto particular de compuestos para su toxicidad se puede realizar en un formato de placa de 96 a 384 pocillos en cuestión de días. El análisis secundario de h positivosu se puede realizar para determinar si las anomalías cromosómicas se originaron de interrupción meiótica o desde los primeros errores segregación cromosómica embrionarias. En total, este ensayo representa una estrategia de primer paso rápido para la evaluación rápida de la disfunción de la línea germinal después de la exposición química.

La exposición de la Pxol-1 :: GFP reportero cepa a los agentes químicos tales como el veneno de microtúbulos Nocodazol (Figura 1) conduce a la inducción de una alta proporción de embriones que expresan GFP en el útero de hermafroditas adultos expuestos en comparación con el control de DMSO. Los embriones GFP-positivas son significativamente más brillante que el débil fluorescencia de fondo observado en otros embriones, así como la auto-fluorescencia observada en el intestino de los an...

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K vistas.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Humano madre pluripotentes células Basado Toxicidad para el desarrollo de ensayos de la seguridad química Detección y biología de sistemas de generación de datos

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...