Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el ciclo celular y la dinámica de la población de células madre de la línea germinal en C.elegans. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere transgenes, es compatible con la tinción inmunofluorescente, y se puede modificar para estudiar células en muchas condiciones diferentes. Estaba muy emocionado cuando vi por primera vez este método que se utilizaba en el laboratorio de Scheda.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el ciclo celular de C.elegans, también se puede aplicar a preguntas más amplias sobre el envejecimiento, nutrición o genotipos alterados. Generalmente los laboratorios nuevos en este método pueden luchar con la idiodisprepción inicial o la tinción de hematoxilina de C.elegans. Comience por el uso de la técnica estéril para añadir 200 microlitros de 10 mililitros EdU en 100 mililitros de tampón M9 y los suplementos apropiados a cuatro mililitros de recién crecido durante la noche MG 1693 E.coli cultivo.
Hacer idiodisceso requiere un delicado equilibrio entre la suplementación de EdU y timidina. Como la cantidad de timidina debe ser suficiente para que la coli de E crezca bien, mientras que la cantidad de EdU debe ser suficiente para el escudo robusto contra la nivelación. Después de no más de 24 horas a 37 grados Celsius y 200 RPM, utilice una técnica estéril para dividir el cultivo entre dos y cuatro tubos cónicos estériles de 50 mililitros para la centrifugación.
Resuspender la pellatina cuatro mililitros de tampón M9 fresco y utilizar la misma pipeta para aplicar alrededor de 8 gotas de EdU etiquetada E Coli MG1693 solución al centro de temperatura ambiente individual 60 mililitro M9 A placas de petri de protección. Para alimentar las bacterias etiquetadas por EdU a los nematodos, utilice PBS fresco para lavar a los C.Elegans de un plato medio de crecimiento de nematodos en un tubo de 1,5 mililitros y permitir que los animales se asienten brevemente por gravedad. Lavar a los animales una o dos veces con un mililitro de PBS y utilizar una pipeta de pasteur de vidrio para transferir los nematodos al centro del césped de EdU en una pequeña gota de PBS.
Espere unos minutos a que el líquido sea absorbido e incubar el cultivo durante al menos 30 minutos a 20 grados centígrados según el protocolo experimental. Al final de la incubación, utilice dos mililitros de PBS para lavar los gusanos de la placa de cultivo de EdU en un plato diseccionado de vidrio. Después de la disección y fijación de las gónadas de nematodos como se describió anteriormente, enjuague un pequeño tubo de vidrio de borosilicato de un mililitro y una pipeta de pasteur de vidrio largo con PBS complementada con 0.1%tween 20 y utilice la pipeta para transferir las gónadas fijas al tubo en una pequeña cantidad de tween PBS.
Recoger las gónadas por centrifugación y utilizar una pipeta de pasto de vidrio largo, dibujado para eliminar tanto sobrenadante como sea posible sin perturbar el pellet de gónada. Para la detección de EdU, agregue 100 microlitros de cóctel EdU click a las gónadas y cubra el tubo con película de laboratorio para una incubación de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las gónadas una vez con 100 microlitros de tampón de enjuague por reacción, y cuatro veces con un mililitro de interpolación PBS.
Después del último lavado, agregue 25 microlitros de medio de montaje anti-fade complementados con DAPI a la muestra. Mientras el medio se asienta sobre las gónadas, coloque una almohadilla grande de 2,5% de agarosa en un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar. A continuación, aplanar con una segunda diapositiva.
A continuación, utilice una pipeta de pasteur de vidrio largo y mantenga todo el líquido y las gónadas en la punta estrecha de la pipeta para minimizar la pérdida de la muestra al transferir las gónadas a la almohadilla. Usando una pestaña pegada a un palillo de dientes, distribuya las gónadas sobre la almohadilla de agarosa y elimine las partículas de polvo. A continuación, baje lentamente un resbalón de cubierta de vidrio rectangular sobre las gónadas, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire, y eliminando cualquier exceso de solución con un tejido de laboratorio.
Contar celdas en tres dimensiones de forma fiable requiere cierta práctica. El uso del plug-in de contador de celdas de Fiji y un script como marcas las celdas para eliminar los duplicados ayuda a que los recuentos sean reproducibles. Después de permitir que el resguardo de la cubierta se asiente durante la noche, utilice el plug-in del contador de células y Fiji para contar manualmente cada núcleo, etiquetando cada núcleo individual de acuerdo con la presencia o ausencia de fosfohistone tres EdU o etiquetado de celda de zona pregenetor.
La señal EdU se co-localiza con la señal DAPI. En algunos núcleos, la señal EdU cubre todos los cromosomas, mientras que en otros núcleos, la señal EdU se localiza en uno a dos punkta brillante, probablemente en el cromosoma X, que se replica al final de la fase S. La señal EdU de un etiquetado exitoso de 30 minutos se localiza a aproximadamente la mitad de los núcleos en la zona del pregénero.
Mientras que la técnica funciona consistentemente en animales adultos jóvenes de tipo salvaje, una fracción significativa de hermafroditas de 5 días de edad apareadas no se etiqueta en un pulso de EdU de 30 minutos. La duración del G2 se puede estimar analizando el porcentaje de núcleos en la fase M que son positivos de EdU en el curso de tiempo, permitiendo el cálculo de la mediana y la duración máxima de G2. La duración de G2 y G1 se puede estimar a partir del porcentaje de todos los núcleos de zona de pregenetor que son positivos EdU, lo que permite calcular la duración máxima de las fases combinadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar el mismo lote de platos EdU para minimizar la variabilidad interme experimental.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la tinción con anticuerpos adicionales o responder preguntas adicionales sobre el ciclo celular, el destino celular o las vías de señalización. No olvide que trabajar con análogos de núcleos y parafermeldahyde puede ser peligroso, y que las precauciones, como el uso de guantes nitrol, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
