El analizador de subestructuras es un flujo de trabajo fácil de usar que realiza análisis automáticos de múltiples métricas de microscopía de procesos. No significa cero toneladas de software de código abierto Icy y también el uso de funcionalidades de la máquina. Es importante destacar que este flujo de trabajo es asequible y produce conocimientos y análisis de imágenes.
Las imágenes multicanal se cargan dentro del flujo de trabajo y se procesan previamente para mejorar la relación señal-ruido y eliminar imágenes o defectos. A continuación, la segmentación de imágenes aísla las regiones de interés, también conocidas como ROI del fondo. Varios métodos de segmentación están disponibles dependiendo del nivel de agrupación en clústeres y la naturaleza de los objetos de interés.
Los objetos segmentados se guardan con un descriptor específico en una carpeta específica. La fuerza y las señales se analizan dentro de las filas y varias entidades, como la ubicación, el tamaño, la forma en las texturas de densidad, pero el número y el tamaño se exportan a una hoja de cálculo creada automáticamente. Descarga Icy desde el sitio web de Icy.
A continuación, descargue Substructure Analyzer Protocol de la biblioteca de protocolos Icy. Abra Icy y haga clic en las herramientas del menú de la cinta de opciones. Haga clic en los protocolos para abrir la interfaz del editor de protocolos.
Haga clic en cargar y abra el analizador de subestructuras de protocolo. La carga del protocolo puede tardar unos segundos. El flujo de trabajo se compone de 13 bloques generales cada bloque que funcionan como una canalización compuesta por varias cajas que realizan subtareas específicas.
Cada bloque o cuadro está numerado y tiene un rango específico dentro del flujo de trabajo. Al hacer clic en este número, asigne la posición más cercana posible a la primera al bloque seleccionado. Las posiciones de los otros bloques se reorganizan.
Al hacer clic en el icono de la esquina superior izquierda, el bloque se puede contraer expandido. También se puede agrandar, estrechar o eliminar. Cada canalización del flujo de trabajo es correcta surgida por una red de cuadros conectados entre sí por otra entrada y salida.
Para crear una conexión, haga clic en una salida y mantenga hasta que el cursor pertenezca a cualquier entrada. Las conexiones se pueden eliminar haciendo clic en la etiqueta de salida. Si es necesario cambiar el nombre de los archivos para que las secuencias que se van a combinar, tienen el mismo prefijo de nombres seguido de separador distinto.
Por ejemplo, las secuencias de canales individuales de una imagen A se denominan imagen A de subrayado rojo, imagen A subrayado azul, etc. En la misma carpeta, cree una nueva carpeta por canal para combinar. Por ejemplo, para combinar canales rojos, verdes y azules, cree tres carpetas y almacene las secuencias correspondientes dentro de estas carpetas.
Utilice solo los canales de combinación de bloques, elimine los otros bloques y guarde el protocolo como canales de fusión. Acceso a las cajas para fijar los parámetros. En el cuadro, número de canal x, elija qué canal extraer.
En las imágenes RGB clásicas, cero es rojo, uno es verde y dos es azul. En el cuadro, número de canal de carpeta x, barra diagonal diagonal posterior el nombre de la carpeta que contiene imágenes del canal x. En el cuadro, separe el número de canal x.
El separador se utiliza para el nombre de la imagen. En el cuadro, el número de canal de mapa de color x, indique con un número qué columna del modelo utilizar para visualizar el canal correspondiente en Icy. En el cuadro, formato de imágenes combinadas, escriba la extensión para guardar imágenes combinadas.
En la esquina superior izquierda del bloque de canales de fusión, haga clic en el enlace directamente a la derecha de la carpeta. En el cuadro de diálogo abierto que aparece, haga doble clic en la carpeta que contiene secuencias del primer canal que se ha definido en el canal de la carpeta de cuadro número uno. A continuación, haga clic en abrir, ejecutó el protocolo.
Las imágenes combinadas se guardan en una carpeta combinada en el mismo directorio que las carpetas de canales individuales. La segmentación de objetos, es el paso más difícil en el análisis de imágenes. Su eficiencia determina la precisión de las mediciones resultantes.
Por lo tanto, el analizador de estructura integra algoritmos simples y más complejos para proponer diferentes alternativas adaptadas a la complejidad de la imagen y las necesidades del usuario. Si los objetos no se tocan entre sí, otro usuario no necesita diferenciar los objetos agrupados individualmente utilizar la segmentación de bloques A.Cuando los objetos no se tocan entre sí, pero algunos de ellos están muy cerca, utilice la segmentación de bloques B.Para objetos con un nivel de agrupación en clústeres alto y una forma convexa, utilice la segmentación de bloques C.Si los objetos presentan un nivel de agrupación alto y tienen formas irregulares , utilice la segmentación de bloques D.Utilice la segmentación de bloques en el citoplasma de clústeres para segmentar el citoplasma que toca individualmente utilizando núcleos segmentados como marcadores. La adaptación de bloques para la segmentación de objetos primarios puede procesarse de forma independiente para que varios bloques se puedan utilizar en la misma ejecución para comparar su eficiencia para una subestructura determinada o para segmentar diferentes tipos de subestructuras.
Para ilustrar la segmentación, se ha elegido la segmentación de bloques B, que se ajustará a un mayor número de problemas. Para usar este blog. En primer lugar, vincúlalo para seleccionar la carpeta.
A continuación, invoca la señal de canal que establece el canal del objeto en segmentar. Por ejemplo, para corresponder a la B, en el cuadro HK significa, establezca el parámetro intensity classes y los tamaños mínimo y máximo aproximados en píxeles de objetos que se van a detectar. Para las clases de intensidad, un valor de dos clasificará los píxeles en dos clases, fondo y primer plano.
Por lo tanto, se adapta cuando el contraste entre los objetos y el fondo es alto. Si los objetos de primer plano tienen sus intensidades de origen, o el contraste con el fondo es bajo, aumente el número de clases. En el cuadro, los contornos activos optimizan la detección de bordes de objetos.
Durante el proceso, se creará una carpeta para guardar imágenes de objetos segmentados. En el texto del cuadro, asigne un nombre a esta carpeta, por ejemplo, segmentando núcleos. Para establecer el formato para guardar imágenes de objetos segmentados, rellene el formato de cuadro de las imágenes de objetos segmentados, ejecutó el protocolo.
La carpeta se crea en la carpeta que contiene imágenes combinadas. Se han desarrollado diferentes bloques para adaptarse al número de leyes y canales y compartimentos celulares a analizar en objetos segmentados. En el ejemplo siguiente, para el análisis, elija el análisis de fluorescencia de bloque P.Two canales en el mismo compartimiento y vincúlalo para seleccionar la carpeta.
El bloque de segmentación debería haberse procesado antes de que este análisis estableciera el ROI de las imágenes de la carpeta de bandeja de entrada de parámetros, escriba el nombre de la carpeta que contiene imágenes de objetos segmentados precedidos por una barra diagonal invertida. Formato de bandeja de entrada de imágenes de objetos segmentados, escriba el formato utilizado para guardar imágenes de objetos segmentados. Los bordes de eliminación de la bandeja de entrada para eliminar ambos objetos.
De lo contrario, ahora mismo, se requiere la instalación de la colección más completa J de imágenes para utilizar esta función. En las casillas de la señal de punto del canal, ajuste el canal donde se deben detectar los puntos. En las imágenes RTP clásicas, cero es rojo Uno es verde y dos es azul.
En cajas nombre de molécula localizada, escriba el nombre de la molécula que se localiza en las manchas. El número de campos a responder depende del número de moléculas. En las longitudes de onda de las cajas por bloque detector, establezca los parámetros de detección de puntos para cada canal individual.
Para procesar diferentes bloques en una habitación, mantenga las conexiones de los bloques elegidos, con la carpeta de selección de bloques. Asegúrese de que sus filas están por debajo del buen procesamiento del flujo de trabajo. Antes de ejecutar el flujo de trabajo, también se recomienda quitar los bloques no utilizados y guardar el nuevo protocolo con otro nombre.
Haga clic en Ejecutar para iniciar el flujo de trabajo. Cuando se abre mirada mira, aparecen libros. Haga doble clic en la carpeta que contiene las imágenes de enfermeraS Luego haga clic en Abrir, el flujo de trabajo se ejecutará automáticamente.
Si el procesamiento se completa el mensaje, el flujo de trabajo ejecutado correctamente aparecerá en la esquina inferior derecha, todos los bloques se marcarán con el signo verde. Si no es el bloque y el cuadro interior que presenta el signo de flecha indicará los elementos correctos. Es importante destacar que varias pantallas permiten visualizar los resultados intermedios durante cada ejecución para controlar el procesamiento.
La rapidez, flexibilidad y funcionalidad de este flujo de trabajo se limitarán a varios ejemplos. En este primer ejemplo, analizamos la translocación nuclear de NF kappa B.Después de la simulación con concentraciones crecientes de TNF alfa. Los núcleos y el citoplasma se delinearon utilizando bloques de segmentación C y E.
El florecimiento de la kappa B de NF en la señal se analizó utilizando el bloque de análisis de translocación global. Más de 40.000 células en 96 imágenes fueron analizadas en 26 minutos. Los datos generados se utilizaron para establecer esta curva de respuesta a la dosis que muestra la inducción de la translocación nuclear NF Kappa B por TNF alfa.
El flujo de trabajo también se puede utilizar para detectar el tamaño del archivo y extraer información específica sobre sus características. Aquí, las propiedades en las células individuales se detectaron mediante la localización de la EDC para la proteína. Los núcleos en el citoplasma se delinearon utilizando bloques de segmentación A y E.
EDC4 se analizó utilizando bloques de análisis de fluorescencia C.In este ejemplo, se ha detectado un signo EDC4 citoplasmático en ambas células analizadas. El tamaño en píxeles de cada lado completo se indica en la hoja de cálculo. En este ejemplo, aprovechamos la versatilidad del flujo de trabajo para estudiar los carbohidratos una cinética más larga del estrés oxidativo.
El signo de fuerza nuclear de la bobina son los principales componentes estructurales de los carbohidratos Su número y tamaño fueron analizados de acuerdo con el tamaño, estado de tensión, evaluado por roturas de doble hebra localizadas con 53BP1. Los núcleos fueron delineados usando proxy de segmentación, fuerza nuclear y señales de bobina y 53BP1, fueron analizados simultáneamente usando el análisis de fluorescencia Bloque B.Utilizando datos de 2300 células individuales, evidenciamos un aumento significativo del número de sitio de Greenfield después de la inducción de estrés asociado con una disminución de su tamaño. Estos datos sugieren firmemente que el estrés oxidativo cambia el poder de nucleación de un carbohidrato en el uso de una distribución plasmica nuclear en número de nucleares más pequeñas para el sitio para justificar un cambio en la expresión de bobina podría alterar su localización y cambiar la nucleación de cuerpos de curva.
Se sobreexpresó una proteína exógena de fusión de bobina de GFP. Las características de nuestros cuerpos fueron analizadas de acuerdo con el nivel de sobreexpresión de bobina GFP. Los núcleos se delinearon utilizando el bloque de segmentación A.Las señales fluorescentes de bobina y bobina GFP, se analizaron simultáneamente utilizando el bloque de análisis de fluorescencia B.El nivel de sobreexpresión de la bobina GFP se refletió por el significado de densidad de la señal GFP en núcleos individuales.
Los datos generados por el analizador de subestructura muestran que la bobina GFP en la sobreexpresión aumenta significativamente el tamaño y el número de carbohidratos. Dado que el estrés oxidativo aumenta el número de carbohidratos pero reduce su tamaño. Estos datos podrían reflejar que el efecto de estrés oxidativo en la estructura de los carbohidratos es probablemente inducido por un cambio de su composición en lugar de por un efecto sobre cierta cantidad de bobina.
Así que el analizador de estructura es un flujo de trabajo altamente modular para el análisis de imágenes biológicas. Se puede adaptar a varios contextos desde la simple fusión de canales hasta la cuantificación de múltiples pisos y señales en miles de células. También integra algoritmos de segmentación simples y complejos dependiendo de la complejidad de la imagen y automatiza la extracción de entidades de señal fluorescente.
