Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

O analisador de subestrutura é um fluxo de trabalho amigável que realiza a análise automática de múltiplas métricas de microscopia de processos. Isso não significa zero toneladas de software de código aberto Icy e também usando funcionalidades de máquinas. É importante ressaltar que esse fluxo de trabalho é acessível, produzindo conhecimento e análise de imagens.

As imagens multicanais são carregadas dentro do fluxo de trabalho e pré-processadas, a fim de melhorar a relação sinal/ruído e remover imagens ou defeitos. Em seguida, a segmentação de imagens isola regiões de interesse, também conhecidas como ROIs a partir do fundo. Vários métodos de segmentação estão disponíveis dependendo do nível de agrupamento e da natureza dos objetos de interesse.

Objetos segmentados são salvos com um descritor específico em uma pasta específica. Força e sinais são então analisados dentro das linhas e vários recursos, como localização, tamanho, forma em texturas de densidade, mas número e tamanho são exportados para uma planilha criada automaticamente. Baixe Icy no site da Icy.

Em seguida, baixe Substructure Analyzer Protocol da biblioteca de protocolos Icy. Abra o Gelo e clique em ferramentas no menu da fita. Clique em protocolos para abrir a interface do editor de protocolos.

Clique na carga e abra o analisador de subestrutura de protocolo. O carregamento do protocolo pode levar alguns segundos. O fluxo de trabalho é composto por 13 blocos gerais cada bloco funcionando como um pipeline composto por várias caixas executando subtarefas específicas.

Cada bloco ou caixa é numerado e tem uma classificação específica dentro do fluxo de trabalho. Ao clicar neste número, atribua a posição mais próxima possível à primeira do bloco selecionado. As posições dos outros blocos são reorganizadas.

Clicando no ícone do canto superior esquerdo, o bloco pode ser expandido. Também pode ser ampliado, estreitado ou removido. Cada pipeline do fluxo de trabalho está correto surgido por uma rede de caixas conectadas por outras entradas e saídas.

Para criar uma conexão, clique em uma saída e mantenha até que o cursor pertenha qualquer entrada. As conexões podem ser removidas clicando na tag de saída. Se necessário renomear os arquivos para que as sequências sejam mescladas, tenha os mesmos nomes prefixo seguido por separador distinto.

Por exemplo, sequências de canais individuais de uma imagem A são chamadas imagem A sublinhar vermelho, imagem A sublinhar azul, e assim por diante. Na mesma pasta, crie uma nova pasta por canal para mesclar. Por exemplo, para mesclar canais vermelhos, verdes e azuis, crie três pastas e armazene as sequências correspondentes dentro dessas pastas.

Use apenas os canais de fusão do bloco, remova os outros blocos e salve o protocolo como canais de fusão. Acesso às caixas para definir parâmetros. Na caixa, o canal número x, escolha qual canal extrair.

Em imagens RGB clássicas, zero é vermelho, um é verde e dois é azul. Na caixa, pasta do canal número x, Backslash o nome da pasta contendo imagens do canal x. Na caixa, o canal separado número x.

O separador usa para nome de imagem. Na caixa, mapa de cores número x, indicar com um número qual coluna de modelo usar para visualizar o canal correspondente em Gelo. Na caixa, formato de imagens mescladas, escreva a extensão para salvar imagens mescladas.

No canto superior esquerdo do bloco de canais de fusão, clique no link diretamente à direita da pasta. Na caixa de diálogo aberta que aparece, clique duas vezes na pasta contendo sequências do primeiro canal que foi definido no canal da pasta caixa número um. Em seguida, clique em aberto, executou o protocolo.

As imagens mescladas são salvas em uma pasta mesclada no mesmo diretório que as pastas de canais individuais. Segmentação de objetos, é o passo mais desafiador na análise de imagens. Sua eficiência determina a precisão das medições do conjunto resultante.

Assim, o analisador de estruturas integra algoritmos simples e mais complexos para propor diferentes alternativas adaptadas à complexidade da imagem e às necessidades do usuário. Se os objetos não se tocam, outro usuário não precisa diferenciar objetos agrupados individualmente use a segmentação de bloco A.Quando os objetos não se tocam, mas alguns deles estão próximos, use a segmentação do bloco B.Para objetos com alto nível de agrupamento e uma forma convexa, use a segmentação do bloco C.Se os objetos apresentarem um alto nível de agrupamento e tiverem formas irregulares , use a segmentação do bloco D.Use a segmentação do bloco em clusters citoplasma para segmentar o citoplasma de toque individualmente usando núcleos segmentados como marcadores. O bloco adaptativo para segmentação de objetos primários pode processar de forma independente para que vários blocos possam ser usados na mesma execução para comparar sua eficiência com uma subestrutura específica, ou para segmentar diferentes tipos de subestruturas.

Para ilustrar a segmentação, foi escolhida a segmentação do bloco B, que se encaixará em um número maior de questões. Para usar este blog. Primeiro, vincule-o à pasta selecionada.

Em seguida, invoca o sinal do canal definir o canal do objeto para o segmento. Por exemplo, para corresponder ao B, em caixa HK significa, definir o parâmetro de classes de intensidade e os tamanhos mínimos e máximos aproximados em pixels de objetos a serem detectados. Para classes de intensidade, um valor de dois classificará pixels em duas classes, fundo e primeiro plano.

Assim, é adaptado quando o contraste entre os objetos e o fundo é alto. Se objetos em primeiro plano tiverem suas intensidades de origem, ou o contraste com o fundo for baixo, aumente o número de classes. Na caixa, contornos ativos otimizam a detecção de bordas de objetos.

Durante o processo, uma pasta será criada para salvar imagens de objetos segmentados. No texto da caixa, nomeie esta pasta, por exemplo, segmentando núcleos. Para definir o formato para salvar imagens de objetos segmentados, preencha o formato de caixa de imagens de objetos segmentados, executou o protocolo.

A pasta é criada na pasta contendo imagens mescladas. Diferentes blocos foram desenvolvidos para se adaptar ao número de leis e canais e compartimentos celulares a serem analisados em objetos segmentados. No exemplo a seguir, para a análise, escolha a análise de fluorescência de bloco P.Dois canais no mesmo compartimento e vincule-o à pasta selecionada.

O bloco de segmentação deveria ter sido processado antes desta análise definir os parâmetros de imagens da pasta de entrada ROI, escrever o nome da pasta contendo imagens de objetos segmentados precedidos por uma barra traseira. Formato de caixa de imagens de objetos segmentados, escreva o formato usado para salvar imagens de objetos segmentados. A caixa de entrada mata as bordas para remover ambos os objetos.

Caso contrário, neste momento, a instalação da coleção de imagens J mais completa é necessária para usar esta função. Nas caixas canal de sinal spot, defina o canal onde as manchas devem ser detectadas. Nas imagens clássicas do RTP, zero é vermelho Um é verde e dois é azul.

Em caixas nome de molécula localizada, escreva o nome da molécula localizado nos pontos. O número de campos a serem respondidos depende do número de moléculas. Em caixas comprimentos de onda por bloco detector, defina parâmetros de detecção de pontos para cada canal individual.

Para processar diferentes blocos em uma sala, mantenha conexões de blocos escolhidos, com a pasta de seleção de blocos. Certifique-se de que suas fileiras abaixo do bom processamento do fluxo de trabalho. Antes de executar o fluxo de trabalho, também é recomendado remover blocos não uso e salvar o novo protocolo com outro nome.

Clique em execução para iniciar o fluxo de trabalho. Quando abre os olhos, os livros aparecem. Clique duas vezes na pasta que contém as imagens da enfermeira Em seguida, clique em Abrir, o fluxo de trabalho será executado automaticamente.

Se o processamento for concluído, o fluxo de trabalho executado com sucesso aparecerá no canto inferior direito, todos os blocos serão sinalizados com o sinal verde. Se não o bloco e a caixa interna apresentando o sinal de seta indicarão os elementos corretos. É importante ressaltar que vários displays permitem visualizar os resultados intermediários durante cada execução, a fim de controlar o processamento.

A rapidez, flexibilidade e funcionalidade deste fluxo de trabalho serão restritas a vários exemplos. Neste primeiro exemplo, analisamos a translocação nuclear de NF kappa B.Após simulação com concentrações crescentes de TNF alfa. Núcleos e citoplasma foram delineados utilizando blocos de segmentação C e E.

O NF kappa B floresce no sinal foi analisado utilizando-se o bloco global de análise de translocação. Mais de 40 mil células em 96 imagens foram analisadas em 26 minutos. Os dados gerados foram utilizados para estabelecer esta curva de resposta à dose mostrando a indução da translocação nuclear NF Kappa B pela TNF alfa.

O fluxo de trabalho também pode ser usado para detectar o tamanho do arquivo e extrair informações específicas sobre seus recursos. Aqui, propriedades em células individuais foram detectadas localizando o EDC para proteína. Os núcleos em citoplasma foram delineados utilizando blocos de segmentação A e E.

O EDC4 foi analisado utilizando-se blocos de análise de fluorescência C.In este exemplo, o sinal citoplasmado EDC4 foi detectado em ambas as células analisadas. O tamanho em pixels de cada lado completo é dado na planilha. Neste exemplo, aproveitamos a versatilidade do fluxo de trabalho para estudar carboidratos uma cinética mais longa do estresse oxidativo.

Sinal de força nuclear de coilina são os principais componentes estruturais dos carboidratos Seu número e tamanho foram analisados de acordo com o tamanho, estado de estresse, avaliado por quebras duplas de fios localizadas com 53BP1. Os núcleos foram delineados usando proxy de segmentação, força nuclear e sinais de coillina e 53BP1, foram simultaneamente analisados por meio da análise de fluorescência Bloco B.Usando dados de 2300 células individuais, evidenciamos um aumento significativo do número de greenfield após indução de estresse associada a uma diminuição de seu tamanho. Esses dados sugerem fortemente que o estresse oxidativo altera o poder de nucleação de um carboidrato no uso de uma distribuição plasmática nuclear em número de nucleares menores para o local para justificar uma mudança na expressão da coilina poderia alterar sua localização e alterar a nucleação de corpos curvas.

Uma proteína de fusão de coilin GFP exógena foi superexpressa. Características de nossos corpos foram analisadas de acordo com o nível de superexpressão da coilina GFP. Os núcleos foram delineados utilizando o bloco de segmentação A.Os sinais fluorescentes da coilina e da coilina GFP foram simultaneamente analisados utilizando-se o bloco de análise de fluorescência B.O nível de superexpressão da coilina GFP foi refletido pela densidade de significado do sinal GFP em núcleos individuais.

Dados gerados pelo analisador de subestrutura mostram que o coilin GFP em superexpressão aumenta significativamente o tamanho e o número de carboidratos. Uma vez que o estresse oxidativo aumenta o número de carboidratos, mas reduz seu tamanho. Esses dados podem refletir que o efeito de estresse oxidativo na estrutura dos carboidratos é provavelmente induzido por uma mudança de sua composição, em vez de por um efeito sobre determinada quantidade de coilina.

Assim, o analisador de estrutura é um fluxo de trabalho altamente modular para análise de bioimagem. Pode ser adaptado a vários contextos, desde a simples fusão de canais até a quantificação de múltiplos andares e sinais em milhares de células. Também integra algoritmos de segmentação simples e complexos, dependendo da complexidade da imagem e automatiza a extração de recursos de sinal fluorescente.