La capacidad de cuantificar los cambios en la morfología de los tejidos y orgánulos es importante para entender la función génica, así como el impacto de las mutaciones genéticas. Nuestros protocolos explican cómo el software de libre disposición se puede utilizar para evaluar no subjetivamente la morfología de las sinapsis, músculos y mitocondrias en un nematodo, C.elegans. Muchos estudios anteriores han confiado en métodos cualitativos para comparar los cambios morfológicos.
Sin embargo, estos pueden ser problemáticos, ya que pueden no capturar diferencias fenotípicas sutiles, podrían sobrevalorar y subestimar los cambios, y se evalúan subjetivamente. Nuestros métodos cuantitativos proporcionan medios más robustos y menos sesgados para evaluar los cambios morfológicos. Estos métodos podrían utilizarse fácilmente para estudiar los cambios morfológicos en otras estructuras celulares u organismos modelo con el fin de definir la función génica y las consecuencias de las mutaciones asociadas a la enfermedad.
Comience preparando diapositivas para imágenes. Coloque una gota de agarosa derretida en un portaobjetos del microscopio e presione inmediatamente hacia abajo la gota con otro portaobjetos del microscopio, aplanando suavemente la agarosa. Deje que la agarosa se seque durante un minuto y luego separe cuidadosamente las dos diapositivas y deje la almohadilla solidificada en una de las diapositivas.
Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y agregue una gota de cinco a 10 mililitros de anestésico al centro de la almohadilla de agarosa. Utilice un pico esterilizado térmicamente para transferir rápidamente de 10 a 15 animales de la placa de almacenamiento a la gota anestésica antes de que la solución se seque. A continuación, aplique un cubreobjetos posicionándolo justo encima de la almohadilla de agarosa y desabrochando suavemente hacia abajo.
Imagen de las regiones sinápticas con un microscopio confocal de escaneo de línea acoplado a un láser de diodo semiconductor de bomba óptica de 488 y 552 nanómetros y equipado con software de captura de imágenes. Después de localizar los gusanos, cambie a un aumento de 40X y aplique un medio de inmersión. Visualice la región sináptica excitando los fluoróforos con un láser de 552 nanómetros, 1% de potencia para el fluoróforo tagRFP y 488 nanómetros, 2% de potencia para el fluoróforo GFP.
Captura imágenes usando un fotodetector híbrido y establece las ganancias para evitar la sobreexposición de los fluoróforos. Recoge imágenes de la pila Z para cubrir toda la sinapsis usando el tamaño óptimo del paso Z dependiendo del objetivo. Para analizar la región sináptica, comience cargando las imágenes en el software CellProfiler 3.1.5.
Configure el módulo NameAndType y determine la región sináptica mediante la definición manual mediante el tagRFP difuso expresado desde el transgénido UIS-115. Mida el tamaño y la fluorescencia de la sinapsis definida a mano agregando los módulos MeasureObjectSizeShape y MeasureObjectIntensity a la canalización. A continuación, calcule la intensidad de fluorescencia integrada relativa añadiendo el módulo CalculateMath y dividiendo las unidades de intensidad integradas obtenidas de JSIS37 por las obtenidas de UIS-115.
Cuando haya terminado, exporte todas las mediciones y cálculos. Para medir el área de la célula muscular abra la imagen en el software Fiji y utilice la selección de polígonos para trazar cuidadosamente alrededor de una sola célula muscular oblicua. Ajuste la línea del polígono al final arrastrando el punto de anclaje para mejorar el trazado.
Vaya a la pestaña Analizar en la parte superior del software y haga clic en Medir para calcular el área seleccionada. Para las celdas musculares con una región degenerada o faltante, trace el área faltante con la herramienta de selección de polígonos y haga clic en Medir de nuevo. Si hay varios huecos, rastree cada uno por separado.
Calcule la relación del área de separación con el área de toda la celda. Una proporción alta indica una mayor extensión de degeneración muscular. Y si no faltan regiones, la proporción se calcula como cero.
Abra Elastic y elija Pixel Classification en Create New Project. A continuación, cambie el nombre y guarde el proyecto. Vaya a la pestaña de datos de entrada y haga clic en Agregar nuevo y, a continuación, en Agregar imágenes independientes.
Dirija la ventana emergente a la carpeta con los archivos TIF y seleccione la imagen deseada. En la pestaña Selección de entidades, haga clic en Seleccionar entidades para seleccionar todas las entidades de píxel indicadas por las casillas marcadas en verde. La selección de píxeles de este paso se utiliza para distinguir las diferentes clases de píxeles en el paso siguiente.
Utilice un panel de entrenamiento para distinguir entre los filamentos de miosina que expresan la GFP individuales y el fondo no deseado. Haga clic en Añadir etiqueta y garabatee fondos y espacios no deseados entre los filamentos para comenzar el entrenamiento del clasificador. Agregue una segunda etiqueta, cámbiele el nombre a Filamento y gareguee sobre un número de filamentos.
Haga clic en Live Update para asegurarse de que la clasificación se ha realizado correctamente. Si es necesario, agregue más garabatos para afinar el entrenamiento. Una vez realizado el clasificador de entrenamiento, vaya al panel Exportación de predicción y haga clic en Elegir configuración de exportación de imagen con probabilidades como origen.
Asegúrese de que las subregiones de recorte x e y están marcadas y c está desmarcada. Seleccione cero y uno como valores de inicio y detención para c y Convertir tipo de datos a 8 bits sin signo. Marque Renormalizar y, a continuación, cambie el vídeo del archivo de salida a png, cambiando el nombre del archivo y el directorio como desee.
Cierre la ventana Configuración de exportación y exporte la imagen que acaba de segmentarse. A continuación, abra el archivo png en el software Fiji. Ajuste el umbral de la imagen mediante la configuración predeterminada y aplique el complemento de esqueleto, que creará una tabla de resultados independiente.
Este protocolo se ha utilizado para explorar la función de la alfa-tubulina acetiltransferasa MEC-17 en el desarrollo de la sinapsis. El análisis cuantitativo de imágenes de microtúbulos posteriores/laterales o sinapsis PLM indica que la sobreexpresión de MEC-17 interrumpe la función normal de la neurona. En comparación con el tipo de silvestre animales que sobreexpresan MEC-17 han reducido significativamente las regiones presinápticas y la integridad sináptica.
Estas técnicas también se han utilizado para analizar modelos C.elegans de Charcot-Marie-Tooth tipo 2 o CMT2 portadoras de mutaciones en genes asociados a CMT2. La evaluación visual de la morfología muscular de la pared corporal reveló un aumento de 2,5 a 3,5 veces los defectos en los animales de prueba en comparación con el control de tipo salvaje. Los animales con mutaciones en fzo-1 y unc-116 experimentaron pérdida de estrías musculares, acumulación de desechos celulares y degeneración de la fibra muscular.
Mientras que los animales con mutaciones en dyn-1 experimentaron significativamente menos defectos en la morfología muscular. Los mutantes fzo-1 y unc-116 mostraron un aumento de cinco a seis veces en la relación entre la brecha y el área total de una sola célula y una longitud media de fibra dramáticamente más corta en comparación con los animales de tipo salvaje. Para realizar comparaciones entre muestras, es importante determinar las condiciones más óptimas para la adquisición de imágenes y asegurarse de que estas condiciones se utilizan de forma coherente.
Estas técnicas permitirán a los investigadores comparar los cambios morfológicos en diferentes contextos genéticos con enfoques cuantitativos. Esto reduce la subjetividad y, por lo tanto, ayuda a mejorar la representabilidad de los datos generados.
