Los autores desean agradecer a A. Benham para ayudar con el desarrollo del protocolo. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención NS06747 de BAB

1. Preparación de los gusanos de la Imagen Este segmento del protocolo está basado en los C. técnicas de cultivo elegans 1,2, y se describe en la Figura 1. <ol><li> Criar gusanos de alta las placas de agar peptona NGM (10 cm) sembradas con E. NA22 la bacteria E. hasta casi morir de hambre. Si inmunotinción, una placa, producirá gusanos suficientes para una persona mancha, teniendo en cuenta las pérdidas a lo largo del camino, y los estrictos criterios utilizados para seleccionar a los gusanos de imagen (véase la Parte 2). </li><li> Gusanos de cosecha de verter algunos mililitros de ddH 2 0 en la placa, girando brevemente, y verter el líquido en un tubo cónico de 15 ml (repetir si es necesario para transferir la mayor parte de los gusanos en el tubo). Pellet en centrífuga clínica durante 3 min, g 1000x. Lavar precipitado 1-3x con ddH2O hasta el sobrenadante es claro para eliminar las bacterias residuales. Utilizar pipetas de polipropileno de transferencia para eliminar sobrenadantes, como gusanos se adhieren al vidrio(A partir de este paso es fundamental para minimizar el tiempo entre los pasos para evitar pérdidas en la viabilidad de los huevos). </li><li> Después del último lavado, resuspender el pellet en gusano de 5 ml de solución de hipoclorito alcalino para lisar los gusanos y los huevos de liberación. Rock suave, y examinar los tubos bajo un microscopio de disección de una vez por minuto. Cuando el 50% de los gusanos se lisan (aparecerán doblado y roto abierto), terminar la lisis por el tubo de llenado a la parte superior con tampón de huevo, invirtiendo varias veces, y la granulación durante 3 min, 1000x g. Lisis tiempo no debe exceder de 5 minutos. </li><li> Eliminar el sobrenadante con una pipeta de transferencia, y lavar la pastilla 3 veces con tampón de huevo. </li><li> Para separar los huevos de los desechos, flotar sobre un colchón de sacarosa al 30% en ddH 2 O: después del lavado final de la etapa 1.4, quite cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 ml de ddH 2 0. Añadir 5 ml de sacarosa al 60% en ddH2O, y mezclar bien. Gira en centrífuga clínica 6 min, g 1000x. Los huevos se recogen en el menisco (se de HaVe un aspecto turbio), mientras que los desechos se pellet. </li><li> Utilizando una pipeta de transferencia de plástico, aspirar los huevos en un volumen mínimo y transferir a sembradas placas de agar NGM. Cualquier huevos que se adhieren a lado del tubo se puede enjuagar suavemente hacia abajo y se transfiere también. Una placa de 10 cm de cabeza de serie por cada cepa analizada es suficiente. </li><li> Incubar las placas sembradas con los huevos durante la noche (~ 16 h) a 20 ° C. Ventile la placa durante las primeras horas para que se seque, dejando la tapa un poco fuera por unas horas, pero asegúrese de cubrir durante la noche. </li><li> Después de la eclosión, las larvas L1 transferir a un tubo cónico de 15 ml en el basal S (añadir unos pocos ml S a la placa basal, remolino, verter en el tubo). Pellet en centrífuga clínica (3 min, 1000x g), resuspender en un volumen mínimo de S basal, y la transferencia de hasta 10 cm placas de agar sembradas con NGM NA22 bacterias. Usar 2 placas de aquí para cada plato original del paso 1.1. Incubar hasta que los gusanos lleguen a la edad deseada. </li><li> Monitorear las culturas una o dos veces por día. Si ellos están en peligro of muriendo de hambre, la transferencia a nuevas NA22 placas. Para los gusanos N2 de tipo salvaje, el hambre es precedida por la formación de una línea o una ola de gusanos que se mueve a través de la placa como los animales emigran en masa lejos de alimentos agotadas zonas. Una vez que estas formas, la comida va a estar definitivamente agotado en pocas horas. </li><li> Los gusanos ya están listos para inmunotinción o imágenes en vivo. Fijación y tinción gusanos en suspensión es óptimo, ya que un gran número de gusanos intactos se pueden visualizar fácilmente. Los procedimientos de tinción basados ​​en el protocolo de Finney y Ruvkun 3-6 son preferibles a las heladas agrieten los procedimientos, porque un gran número de gusanos son necesarios para la creación de imágenes. </li></ol> 2. Confocal de imágenes <ol><li> Montar los gusanos en las diapositivas de imagen confocal. Ajuste la densidad de gusanos a unos pocos centenares por microlitro. Hacer una almohadilla de agarosa al 2% en S-basal rodeado por un delgado anillo de vaselina para evitar la evaporación durante la imagen (aplicado a través de una jeringa de 3 ml equipado con una aguja de calibre de corte 25). Pipetearpocos microlitros de la suspensión de gusano en una hoja de cubierta (uso de anestesia, si imagen gusanos vivos), y bajar la plataforma de agarosa en la hoja de la cubierta, la difusión de los gusanos de manera uniforme sobre la almohadilla. </li><li> Seleccione gusanos para obtener imágenes. Seleccione gusanos en las sinapsis de interés se orientan a la lente del objetivo, con el desplazamiento radial de no más de ± 45 ° (donde 0 ° significa que está orientado directamente hacia el objetivo). Lleve a cabo esta evaluación rápida (unos segundos) para evitar photobleaching. La escala de los cultivos iniciales se optimiza para asegurar suficientes gusanos se satisfacen estos criterios geométricos. </li><li> Completa la imagen confocal de la muestra. Muestras relativamente planas que pueden ser comprendidas dentro de aproximadamente 14 micras de espesor 0,4 secciones producir los mejores resultados. De alta velocidad, las imágenes de baja resolución (512 x 512 píxeles) son suficientes para la rápida recolección de datos precisos. Evite saturar el detector con intensidades de señal excesivas, ya que esto causará una subestimación de la fluorescenciaseñales. </li></ol> 3. Automático de Identificación y Análisis de Clusters sinápticas individuales <ol><li> Abrir varios archivos TIF de salida del microscopio confocal utilizando Volocity 4.0 (o superior) (PerkinElmer). </li><li> Cultivos de distancia áreas de la imagen que no contienen la estructura de interés (Imagen -&gt; Focus extendida -&gt; Seleccionar área de interés mediante &quot;Freehand ROI Tool -&gt; Acciones -&gt; Recortar a la selección, la Figura 2A). Tenga en cuenta, de enfoque extendido produce una proyección plano z en la pantalla de la computadora para ayudar a su análisis, pero no afecta a los datos subyacentes, lo mismo es cierto para los ajustes de brillo y contraste, si es necesario). </li><li> Medir la longitud de la zona analizada utilizando la herramienta Línea. La longitud de la línea se calcula y se añade a la tabla de datos (Figura 2B). </li><li> Identificar los objetos que utilizan los &#39;Objetos de intensidad&#39; filtro (modo de Medidas). Especifique un umbral de tal manera que las agrupaciones son sinápticaspuso de relieve y no-sináptica de fondo no es (Fig. 2C). La inclusión de un marcador independiente sináptica marcado con otro color puede ayudar a identificar inequívocamente las sinapsis. Sinapsis típicas van desde unos pocos a unos pocos cientos de voxels. Establecer el umbral de una vez usando una muestra de control, y lo utilizan para todas las muestras posteriores. Umbral cada muestra por separado es inaceptable porque introduce la posibilidad de sesgo del experimentador. Los objetos se seleccionan y se tabulan automáticamente (Figura 2D). </li><li> Organizar y exportar los datos. Eliminar objetos de 2 o menos voxels, ya que por lo general son manchas de fondo. Estos pueden ser eliminados por filtrado adicionales, o durante su posterior análisis. Para facilitar su posterior eliminación, re-ordenar el archivo de datos &quot;el tamaño del objeto &#39;ellos también lo harán todos los grupos juntos. Exportar los datos en formato CSV, lo que puede ser abierto por Microsoft Excel u otros programas de hoja de cálculo. Cada imagen produce un archivo de salida. </li><li> Si Volocity suavesoftware son los métodos alternativos no están disponibles, para analizar Z-Plane proyecciones de los datos confocal se puede utilizar (por ejemplo ref. 7, o el análisis manual de uso de ImageJ), aunque en 3 dimensiones se pierde información (ver Discusión). </li></ol> 4. Los resultados representativos El método de cuantificación que aparece debería ser capaz de distinguir entre las poblaciones de racimo de diferente brillo y volúmenes diferentes. Imágenes representativas y los correspondientes datos cuantitativos presentados en la Figura 3 muestran ejemplos de diferenciación sobre la base de estos parámetros. Como regla general, los resultados deben ajustarse a lo que es evidente para el ojo. En el caso de UNC-49 receptor de GABA inmunotinción el cordón nervioso ventral de C. elegans, todos los animales por lo general parecían muy similares en tamaño y madurez, y el total de los valores sinápticos de fluorescencia para un grupo de cinco gusanos (normalizada a la longitud del cordón nervioso analizados) mostró Error estándar<html> valores de aproximadamente 10% de la media 4. La mutación genética y otros tratamientos experimentales (por ejemplo, exposición de drogas) pueden alterar no sólo el volumen y los valores de la intensidad y la distribución de frecuencias de grupos sinápticos, pero posiblemente el desarrollo del curso temporal y la sincronía de los gusanos, lo que lleva a una mayor variabilidad. Sin embargo, los resultados cuantitativos siempre debe reflejar lo que se puede apreciar visualmente y si no, la inspección de las imágenes y los objetos identificados por Volocity debe revelar donde ocurrió el error y sugerir las medidas correctivas, tales como re-umbral o eliminación de objetos artefactuales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> Figura 1. Preparación de síncrono C. culturas elegans. culturas sincrónicas se obtienen de este procedimiento, pues C. elegans arrestos de desarrollo y de la fase L1 larvas en la falta de alimentos, y se reanuda cuando el alimento se introduce. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> Figura 2. La cuantificación de puncta sináptica. <ol class="ualpha"><li> Regiones extrañas de la imagen se recortan para reducir el tamaño de los archivos y aumentar la especificidad. Panel de la izquierda muestra a partir de la imagen, el panel medio muestra la región seleccionada, el panel derecho muestra la imagen después del recorte. El rojo es señal de la UNC-49 de inmunofluorescencia receptor GABA, la señal verde es sinaptobrevina-GFP (un marcador presináptico) se expresa en neuronas GABA presinápticos 4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li><li> Se traza una línea de la longitud del segmento de la médula nerviosa a analizar, y su longitud se graba automáticamente en la tabla de resultados. Esta información es necesaria para normalizar los datos sinápticas debido a la longitud de cordón nervioso analizable, que puede variar varias veces si gusanos se fragmentan durante la tinción.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande figura. </li><li> Un umbral se aplica para identificar agrupaciones individuales sinápticas. Panel de la izquierda muestra la imagen antes de umbral; ejemplos de niveles de umbralización diferentes se muestran en paneles separados (señal verde se omite). Cada objeto identificado se representa en la imagen como una región coloreada. Tenga en cuenta la correspondencia entre los grupos sinápticos visualmente evidentes en el panel más a la izquierda y las regiones de colores en el panel derecho de la mayoría. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li><li> Cada objeto identificado está en la lista por separado en la tabla de resultados. Objetos pueden ser seleccionados, y se destacan en la imagen para la inspección, si lo desea. Tenga en cuenta que la tabla contiene información para el rojo (&quot;rodamina &#39;) y verde (&#39; EGFP &#39;) canales, la información del canal verde es potencialmente engañoso ya que los objetos fueronidentificados con base estrictamente en la fluorescencia de color rojo. Este análisis también se puede realizar en las imágenes de un solo color. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos. Micrografías representativas de tipo salvaje C. elegans teñidas para UNC-49 antes de receptores de GABA (A) y después (B) el tratamiento con el muscimol, un agonista de los receptores GABA que provoca receptores para convertirse en downregulated después de una larga exposición. Los paneles muestran imágenes recortadas antes (izquierda) y después (derecha) de umbral y la eliminación de manchas pequeñas de fondo. (C) Las representaciones de los parámetros cuantitativos sinápticas de los modelos que figuran en (A) y (B): total de fluorescencia normalizada a la longitud del nervio espinal (izquierda), y los histogramas de probabilidad acumulativa de contenido individual de fluorescencia sinapsis (centro) y el volumen de sinapsis (right), lo que demuestra una reducción estadísticamente significativa en el contenido y el volumen sináptica inducida por la exposición agonista (n = 60 sinapsis para tratar, n = 115 sinapsis para muscimol tratado, p &lt;0,001, test de Kolmogorov-Smirnov <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método que aquí se presenta está diseñado para extraer parámetros cuantitativos de múltiples datos para grandes poblaciones de las sinapsis en C. elegans, al tiempo que maximiza la consistencia dentro de los grupos de tratamiento. Tres características de contribuir a estos objetivos. En primer lugar, inmunotinción se realiza en las poblaciones de gusano síncronos para asegurar que todos los animales tienen la misma edad. Este paso es crítico porque la regulación del desarrollo de los niveles de ex...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del software </td><td> Empresa </td><td></td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 o superior </td><td> PerkinElmer / Improvisación </td><td></td><td> Revise su instalación local de imagen básica para el acceso a este software. Software de demostración está disponible en el sitio web de PerkinElmer. Este método requiere sólo el módulo de cuantificación de Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Reactivos específicos y equipos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Huevo de amortiguación </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Ajustar el pH a 7.3) </td> &lt;td&gt; 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Hipoclorito alcalino (por 5 ml) </td><td> Lejía fresca (deseche la botella de 30 días después de la apertura) 10 N NaOH ddH2O </td><td> 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Soluciones. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

Fuerza de la sinapsis se refiere a la amplitud de las respuestas postsinápticas a la liberación de neurotransmisores presinápticos eventos, y tiene un gran impacto en la función global de circuitos neuronales. Fuerza de la sinapsis depende fundamentalmente de la abundancia de receptores de neurotransmisores sinápticos agrupados en los sitios en la membrana postsináptica. Los niveles del receptor se estableció el desarrollo, y pueden ser alterados por el tráfico de receptores entre los depósitos de superficie localizada, subsináptica, e intracelular, lo que representa un importante mecanismo de plasticidad sináptica y la neuromodulación. Rigurosos métodos para cuantificar la abundancia sinápticamente localizado receptores de neurotransmisores son esenciales para estudiar el desarrollo y la plasticidad sináptica. La microscopia de fluorescencia es un método óptimo, ya que preserva la información espacial, distinguiendo sináptica de la no-sinápticas piscinas, y discriminar entre las poblaciones de los receptores localizados en diferentes tipos de sinapsis. El organismo modelo Caenorhabditis genética elegans es especialmente adecuado para estos estudios debido al pequeño tamaño y relativa simplicidad de su sistema nervioso, su transparencia, y la disponibilidad de potentes técnicas genéticas, permitiendo el examen de las sinapsis nativas en animales intactos. Aquí presentamos un método para cuantificar marcadas con fluorescencia receptores de los neurotransmisores sinápticos en C. elegans. Su característica clave es la identificación automática y análisis de las sinapsis individuales en tres dimensiones en varios archivos planos microscopio confocal de salida, la posición de la tabulación, el volumen, la intensidad de fluorescencia, y la fluorescencia total de cada sinapsis. Este enfoque tiene dos ventajas principales sobre el análisis manual de las proyecciones de Z-Plane de datos confocal. En primer lugar, porque todos los planos del conjunto de datos confocal se incluye, no hay datos se pierden a través de proyección plano z, por lo general basada en las medias de intensidad de pixel o máximos. Identificación En segundo lugar, de las sinapsis es automático, pero puede ser inspeccionado por el exexperimentador medida que avanza el análisis de datos, lo que permite la extracción rápida y precisa de los datos de un gran número de sinapsis. Cientos de miles de sinapsis por la muestra se puede obtener fácilmente, produciendo grandes conjuntos de datos para maximizar la potencia estadística. Consideraciones para la preparación de C. elegans para el análisis, y la realización de la imagen confocal para minimizar la variabilidad entre los animales dentro de los grupos de tratamiento también se discuten. Aunque se desarrolló para analizar C. receptores postsinápticos elegans, este método es útil en general para cualquier tipo de sinápticamente-localizada proteína, o de hecho, cualquier señal de fluorescencia que se localiza en racimos discretos, puncta o orgánulos. El procedimiento se realiza en tres etapas: 1) preparación de muestras, 2) imagen confocal, y 3) el análisis de imágenes. Pasos 1 y 2 son específicos a C. elegans, mientras que el paso 3 es generalmente aplicable a cualquier señal de fluorescencia punteada en micrografías confocal.

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

La abundancia de receptores de neurotransmisores en las sinapsis agrupadas influye fuertemente en la fuerza sináptica. Este método cuantifica marcadas con fluorescencia receptores de neurotransmisores en tres dimensiones con una sola sinapsis resolución en<em&gt; C. elegans</em&gt;, Permitiendo cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra sin distorsiones introducidas por proyección plano z.

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K vistas.  University of Toledo. La abundancia de receptores de neurotransmisores en las sinapsis agrupadas influye fuertemente en la fuerza sináptica. Este método cuantifica marcadas con fluorescencia receptores de neurotransmisores en tres dimensiones con una sola sinapsis resolución en C. elegans, Permitiendo cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra sin distorsiones introducidas por proyección plano z.

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

En vivo láser axotomía en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic

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