El cultivo de órganos renales y los orgánulos que se derivan de células madre programadas proporcionan excelentes maneras de estudiar los mecanismos detrás del desarrollo renal y la enfermedad. Sin embargo, el sistema de cultivo de órganos actual no proporciona flujo sanguíneo al riñón. Debido a esto, razón por la que los modelos actuales están incompletos y no recapitulan la función principal del riñón, que es la filtración de sangre.
En esta publicación, presentamos un protocolo mejorado para el cultivo y visualización de riñones embrionarios y organoides en la membrana chorioalantoica del embrión de pollo. En nuestra novedosa configuración experimental, superponemos los rudimentos renales trasplantados en CAM con reservorios de significado permeable que están llenos de medio de cultivo. Este protocolo aumenta significativamente la supervivencia de los rudimentos renales y también las células endoteliales intrínsecas.
El método permite el flujo sanguíneo al glomérulo en desarrollo. Recientemente publicamos también un novedoso método de cultivo de órganos de dirección fija que ofrece imágenes de lapso de tiempo 3D confocal de alta resolución. El método proporcionó condiciones óptimas para la toma de imágenes confocales a largo plazo de los organoides y rudimentos de órganos.
En el enfoque, comprimimos suavemente el tejido entre un resbalón de cubierta de vidrio y una membrana permeable. Aquí mostramos cómo se hacen las placas diseñadas a medida y cómo se configuran los experimentos de cultivo. Así, en esta publicación presentamos una técnica mejorada de cultivo de tubos de orgánulo renal.
Este método ofrece una mejor manera de modelar la génesis del orgánulo y realizar imágenes de alta resolución para estudiar los riñones embrionarios y los organoides renales ex vivo. Dependiendo de su experimento, tome contra-inserciones de celda de transferencia diseñadas para placas de seis o 12 pozos. Corte los lados de la plaquita utilizando una herramienta Dremel para crear un anillo de plástico de dos milímetros de alto con una membrana permeable unida a él.
Pulir los bordes del anillo de swarf con un bisturí o un cuchillo afilado. Esterilice los mini reservorios en 70% etanol durante al menos una hora. A continuación, lave los mini depósitos en autoclave con agua destilada y séquelos en una campana laminar.
Enjuague los mini reservorios en PBS y medio de cultivo. Coloque el depósito en un plato de petri encima de nuestra gota de medio de cultivo con la membrana mirando hacia arriba. Colocar riñones embrionarios ex vivo diseccionados o organoides renales en la membrana.
Evite dejar mucho líquido alrededor de las muestras y déjelas unidas de dos a 24 horas en una incubadora de cultivo celular. El trasplante de exención se realiza a la membrana corioalantoica de pollo embrionario ex ovo de ocho días de edad. Transfiera los mini reservorios para que la membrana cubra el injerto.
Colóquelos en la periferia de la CAM para que no cubran el embrión. A continuación, añada un medio de cultivo a los mini reservorios. Cultivar las muestras en el cam de pollo durante nueve días como máximo.
Sustituya el medio de cultivo en los mini reservorios diariamente. La vascularización de las muestras ya se puede observar de 24 a 48 horas después del trasplante. Para hacer las placas de seis pozos diseñadas a medida para el cultivo fijo.
Es necesario comenzar perforando agujeros de 20 milímetros en la parte inferior de la placa utilizando una máquina de perforación con una broca adecuada. A continuación, pula las llantas de los orificios en la parte superior de la placa. Finalmente, esterilizar las placas en 70%etanol durante al menos una hora.
A continuación, lave las placas en el autoclave con agua destilada y séquelas en la capucha lemiar. Lave los resbalones de cubierta de 22x22 milímetros en 70% etanol y déjelos secar por completo. Pegue el resbalón de la cubierta en la parte superior de un agujero en la parte inferior de un pozo usando pegamento de tejido.
Después del secado, inspeccione las placas bajo un microscopio estéril y retire el exceso de pegamento. En primer lugar, mezclar una alícuota de cuentas de poliestireno con un volumen igual de hidrógeno. Coloque el inserto de transbordo debajo de un microscopio diseccionado con la membrana hacia arriba y coloque los riñones en la membrana.
Agregue una gota de mezcla de perlas de hidro-gel junto a los riñones cuidadosamente. Voltee el inserto transfill para que la membrana y los riñones estén mirando hacia abajo. A continuación, coloque cuidadosamente el inserto en nuestro pozo de placa de seis pozos diseñada a medida.
Empuje el inserto muy suavemente en el pozo. Siga el grado de aplanamiento desde el microscopio hasta que el riñón esté al nivel de las cuentas. Mantenga el inserto ligeramente presionado al pozo con una mano y fijarlo a la placa fundiendo plástico en tres puntos en la periferia de la plaquita con un soldador.
Añadir dos mililitros de cultivo medio en el pozo a través de una abertura en el lado. Al iniciar una toma de imágenes de lapso de tiempo, transfiera la placa a la incubadora en el escenario de un microscopio invertido. Nuestro protocolo de captura CAM modificado permite una vascularización altamente eficiente de organoides renales y riñones embrionarios.
Muchos reservorios que contienen un medio de cultivo suministran tejido de donante y lo protegen del secado durante el período inicial de tiempo que procede del vascularizatón. Esta película muestra el flujo de células sanguíneas de pollo en un centro renal de ratón embrionario injertado en CAM de pollo y cultivado durante siete días. Este panel de figuras muestra que nuestro método de cultivo CAM mejorado proporciona condiciones permisivas para las células endoteliales derivadas renales.
Las figuras A y B muestran riñones embrionarios cultivados durante cinco días en días de cultivo de intervalo fueron injertados en el centro a CAM de pollo durante cinco días. La tinción con los anticuerpos CD-31 de los detalles del ratón muestra que la red celular endotelial del centro renal injertado en CAM es más extensa que en el control del lado izquierdo. En la figura C vemos que los vasos sanguíneos del ratón se tiñen con el anticuerpo CD-31 específico del ratón y eso es lo más con los vasos sanguíneos de pollo.
Las figuras D y E muestran criocciones de riñones embrionarios de ratón cultivados en cultivo de viaje o CAM de pollo durante cinco días y manchados con CD-31 y Hoechst. La vasculatura de glomérulo es más madura en los riñones cultivados en CAM de pollo que en cultivos de control. La Figura F muestra un riñón embrionario de ratón cultivado en CAM de un pollo transgénico de la GFP durante siete días.
Las células endoteliales de ratón están manchadas con anticuerpo CD-31 y podemos observar que la vasculatura en los riñones de ratón xenotrasplante es principalmente, pero no exclusivamente derivada del ratón. El novedoso cultivo de dirección fija permite el cultivo de riñones embrionarios y organoides en una distancia establecida restringida. En una cultura de viaje tradicional, los órganos cultivados se colocan en un filtro que se mantiene en una interfaz de medio aire por una rejilla de metal.
Este método permite buenas condiciones para el desarrollo y crecimiento, pero no es óptimo para la toma de imágenes. En el cultivo de dirección fija, el órgano cultivado se presiona entre un fondo de vidrio de la placa y una membrana y el espesor de la misma es controlado por las cuentas de poliestireno que trabajan como espaciadores aquí. Los órganos en desarrollo se pueden visualizar directamente a través del cristal de la cubierta dando la visión mejorada del órgano.
Este panel de figuras muestra que los riñones embrionarios y los organoides renales se pueden cultivar en el método de cultivo de dirección fija. Las imágenes de campo brillante de riñones embrionarios y organoides renales en el día siete muestran un desarrollo normal. En la figura C, la expresión GFB se ha activado en los nefronas en desarrollo de un organoide renal por la Figura D muestra un riñón con trauma una tinción en el cogollo eurétrico y seis dos manchas que marcan las células precursoras de nefronas.
Las figuras E y F presentan el riñón del ratón cultivado durante 12 días. El trauma y la tinción de nefrona muestran el cogollo eurédico y los podoites. La película también presenta un riñón embrionario de MTMG, origen cree de Taiwán, donde la cree de Taiwán induce la expresión de GFB en las células endoteliales.
Podemos ver que las células endoteliales renales están presentes en el riñón embrionario en desarrollo y la red endotelial también puede desarrollarse en el método de cultivo. En el panel de la derecha, se puede ver cómo las células endoteliales migran a la hendidura vascular de un nefrón en forma de S. Aquí hemos presentado el protocolo mejorado para el xenotrasplante de organoides renales y riñones embrionarios al pollo CAM.
Este protocolo aumenta significativamente la supervivencia de los rudimentos renales y también sus células endoteliales intrínsecas. El método permite el flujo sanguíneo al glomérulo en desarrollo. El otro protocolo presentado aquí es el método de cultivo de órganos de dirección fija que mejora la calidad de la imagen y ayuda a estudiar la génesis del orgánulo a nivel de una sola célula.
Las imágenes de alta resolución son adecuadas para la segmentación celular automatizada y el estudio basado en computadora del comportamiento celular en organoides renales y cultivos renales.
