La investigación de enfermedades cardíacas a menudo se realiza en pequeños y mamíferos como roedores. Sin embargo, la fisiología del corazón humano difiere significativamente de la del corazón del roedor. Nuestro protocolo utiliza cardiomiocitos diferenciados de las células iPS humanas para modelar enfermedades cardíacas isquémicas y cuantificar el daño y deterioro funcional de los cardiomiocitos isquémicos.
Este protocolo puede proporcionar un método conveniente para el cribado personalizado de fármacos utilizando células iPS derivadas de pacientes individuales, el manejo adecuado de las células iPS, como en el uso de medio fresco, y el cambio del medio lenta y puntualmente es fundamental para asegurar una diferenciación exitosa en cardiomiocitos funcionales. Demostrando el procedimiento con Yun Liu, Yin Liang y Mengxue Wang será Chen Wang, un estudiante de doctorado de un laboratorio. Para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en células cardíacas, cubra primero los pozos de una placa de cultivo de 96 pozos con 100 microlitros de 1.675 microgramos por mililitro de laminina en PBS.
Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius, ver tres veces 10 a la cuarta célula madre en 200 microlitros de medio de mantenimiento IPS complementado con 10 micromolares Y27632 en cada pocótulo, y devolver la placa a la Incubadora de Cultivo Celular. Después de 24 horas, sustituya los súper medios por 200 microlitros de medio de crecimiento IPS por pozo, y devuelva la placa a la Incubadora de Cultivo Celular durante dos o tres días adicionales. Cuando las células alcanzan 70 a 80% de confluencia.
Sustituya el medio de cada pozo por 200 microlitros de medio de diferenciación precaluroso A y devuelva la placa a la Incubadora de Cultivo Celular durante otras 48 horas. Al final de la incubación reemplazó lentamente el sobrenadante en cada pozo con 200 microlitros de medio de diferenciación precalentado B y devolver la placa a la Incubadora de Cultivo Celular. Después de dos días, sustituya los sobrenadantes por 200 microlitros de medio de mantenimiento de cardiomiocitos precalentados por pozo y devuelva la placa a la Incubadora de Cultivo Celular durante un máximo de 30 días.
Para evaluar la contractilidad de los cardiomiocitos, instale el plugin de imagen de velocimetría de imagen de partícula y utilice un microscopio de contraste de fase y el objetivo de horquillas para grabar imágenes de vídeo de las células a aproximadamente 20 fotogramas por segundo durante unos 10 segundos. A continuación, guarde el archivo de vídeo como se ha analizado nuestra API y cree una estructura de carpetas como se indica. Para analizar campos vectoriales bidimensionales discretos de desplazamiento celular, inicie VG y seleccione plugins, macros y edite para abrir el análisis vectorial.
ijm, a continuación, haga clic en ejecutar el análisis se realizará automáticamente. Para el tratamiento isquémico, reemplace el sobrenadante en cada pozo con 200 microlitros de dmem sin glucosa y suero, luego coloque la placa en una cámara hipoxiica y luego infunda gas nitrógeno en la cámara, manteniendo la concentración interna de oxígeno en 2% y la concentración de dióxido de carbono en 5% durante 24 horas. Células diferenciadas con éxito, demuestra contracción espontánea como se observa bajo el microscopio con 50% de los pozos de cultivo que típicamente presentan contracción espontánea en menos de 20 días.
La proteína marcadora cardíaca también se puede utilizar para confirmar una diferenciación exitosa Las células del grupo isquémico suelen presentar una menor viabilidad en los ensayos de MTT, y una contractilidad menor que las del grupo de control normódico. La proporción de células positivas de yoduro propidium también es mayor en el grupo isquémico, que en el grupo de control, lo que indica una mayor incidencia de daño celular. Es importante que localice con precisión las regiones de interés en la placa de captura para permitir la comparación de la contractilidad de los cardocitos.
Esta técnica se puede utilizar para el cribado de fármacos, utilizando células iPS derivadas del paciente. También proporciona una plataforma única para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes a las enfermedades cardíacas isquémicas
