A pesquisa de doenças cardíacas é frequentemente realizada em pequenos e mamíferos, como roedores. No entanto, a fisiologia do coração humano difere significativamente da do coração roedor. Nosso protocolo usa cardiomiócitos diferenciados das células iPS humanas para modelar doenças isquêmicas do coração e quantificar os danos e o comprometimento funcional dos cardiomiócitos isquêmicos.
Este protocolo pode fornecer um método conveniente para a triagem personalizada de medicamentos usando células iPS derivadas de pacientes individuais, o manuseio adequado das células iPS, como o uso de meio fresco, e a mudança do meio de forma lenta e pontual é fundamental para garantir uma diferenciação bem sucedida em cardiomiócitos funcionais. Demonstrando o procedimento com Yun Liu, Yin Liang e Mengxue Wang será Chen Wang, um estudante de doutorado de um laboratório. Para induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem em células cardíacas, primeiro cubra os poços de uma placa de cultura de 96 poços com 100 microliters de 1.675 microgramas por mililitro de laminina em PBS.
Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, veja três vezes 10 a quarta células-tronco em 200 microliters de meio de manutenção IPS complementados com 10 micromolar Y27632 em cada poço, e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular. Após 24 horas, substitua os super meios por 200 microliters de meio de crescimento IPS por poço, e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular por mais dois ou três dias. Quando as células atingem 70 a 80% de confluência.
Substitua o meio em cada poço por 200 microliters de meio de diferenciação pré-aquecido A e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular por mais 48 horas. No final da incubação lentamente substituiu o supernaente em cada poço por 200 microliters de meio de diferenciação pré-aquecido B e retornar a placa para a Incubadora de Cultura Celular. Após dois dias, substitua os supernacantes por 200 microlitrais de meio de manutenção de cardiomiócitos pré-aquecidos por poço e devolveu a placa à Incubadora de Cultura Celular por até 30 dias.
Para avaliar a contrailidade dos cardiomiócitos, instale a imagem de velocimetria de partículas j plugin e use um microscópio de contraste de fase e os garfos objetivo para gravar imagens de vídeo das células a aproximadamente 20 quadros por segundo por cerca de 10 segundos. Em seguida, salve o arquivo de vídeo conforme analisado nossa API e crie uma estrutura de pasta como indicado. Para analisar campos vetoriais bidimensionais discretos de deslocamento celular, inicie VG e selecione plugins, macros e edite para abrir a análise vetorial.
ijm, em seguida, clique em executar a análise será realizada automaticamente. Para tratamento isquêmico, substitua o supernaente em cada poço por 200 microliters de dmem sem glicose e soro, em seguida, coloque a placa em uma Câmara Hipoxica e infunda gás nitrogênio na câmara, mantendo a concentração interna de oxigênio em 2% e a concentração de dióxido de carbono em 5% por 24 horas. Células diferenciadas com sucesso, demonstra contração espontânea observada sob o microscópio com 50% dos poços de cultura tipicamente exibindo contração espontânea em menos de 20 dias.
Proteína de marcador cardíaco também pode ser usada para confirmar uma diferenciação bem sucedida As células do grupo isquêmico normalmente apresentam uma menor viabilidade nos ensaios MTT, e uma contratilidade menor do que as do grupo de controle normoxic. A razão de células positivas de iodeto de propídio também é maior no grupo isquêmico do que no grupo controle, indicando maior incidência de danos celulares. É importante que você localize com precisão as regiões de interesse na placa de captura para permitir a comparação da contrativismo dos cardiomiócitos.
Esta técnica pode ser usada para triagem de medicamentos, utilizando células iPS derivadas do paciente. Também fornece uma plataforma única para elucidar ainda mais os mecanismos subjacentes às doenças cardíacas isquêmicas
