심장 병 연구는 수시로 설치류와 같은 작고 포유류에서 행해질 것입니다. 그러나, 인간의 심장의 생리학은 설치류 심장의 것과 크게 다릅니다. 우리의 프로토콜은 허혈성 심장 질환을 모델링하고 허혈성 심근세포의 손상및 기능적 손상을 정량화하기 위해 인간 iPS 세포와 분화된 심근세포를 사용합니다.
이러한 프로토콜은 개별 환자로부터 유래된 iPS 세포를 이용한 맞춤형 약물 스크리닝을 위한 편리한 방법을 제공할 수 있으며, 신선한 배지를 사용하는 것과 같은 iPS 세포의 적절한 취급을 하고, 배지를 천천히 그리고 정시적으로 변경하는 것은 기능성 심근세포로 성공적인 분화를 보장하는 데 매우 중요하다. 윤류, 인량, 멩수왕과 함께 수술을 시연하는 것은 실험실에서 박사 과정 학생인 첸 왕입니다. 인간 유도만능 줄기 세포 분화를 심장 세포로 유도하기 위해, PBS에서 라미닌의 밀리리터 당 1.675 마이크로그램의 100 마이크로리터로 96 웰 배양 판의 우물을 먼저 코팅한다.
섭씨 37도에서 30분 간 배양한 후, 각 웰에 10마이크로몰러 Y27632로 보충된 IPS 유지 보수 매체의 200마이크로리터에서 4번째 줄기세포에 10번 10번을 보고, 세포를 배양 인큐베이터로 되돌려 놓는다. 24시간 후, 슈퍼 수단을 200마이크로리터의 IPS 성장 배지로 교체하고, 2~3일 동안 세포배양인큐베이터로 플레이트를 반납한다. 세포가 70~80%의 합류에 도달하면.
각 우물의 배지를 미리 따뜻하게 한 분화 매체 A의 200 마이크로리터로 교체하고 판을 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 되돌려 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서 천천히 전워진 분화 매체 B의 200 마이크로리터로 각각의 양상체를 대체하고 세포를 배양 인큐베이터로 돌려놓습니다. 이틀 후, 슈퍼네이터를 200마이크로리터의 미리 따뜻하게 된 심근세포 유지 보수 배지로 잘 교체하고 최대 30일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반납한다.
심근세포의 수축도를 평가하기 위해 입자 이미지 속도 측정 이미지 j 플러그인을 설치하고 위상 대비 현미경 및 포크 목표를 사용하여 약 10초 동안 초당 약 20프레임의 셀 의 비디오 이미지를 기록합니다. 그런 다음 API를 분석한 대로 비디오 파일을 저장하고 표시된 대로 폴더 구조를 만듭니다. 셀룰러 변위의 이산 2차원 벡터 필드를 분석하려면 VG를 실행하고 플러그인, 매크로 를 선택하고 벡터 분석을 엽니다.
ijm을 클릭한 다음 분석을 클릭하면 자동으로 수행됩니다. 허혈성 치료의 경우, 각 우물의 상체를 포도당과 혈청없이 200 마이크로 리터로 교체한 다음 저산소 챔버에 플레이트를 넣고 질소 가스를 챔버에 주입하여 내부 산소 농도를 2 %로 유지하고 이산화탄소 농도를 24 시간 동안 5 %로 유지하십시오. 성공적으로 분화 된 세포는, 배양 우물의 50 %로 현미경하에서 관찰된 바와 같이 자발적인 수축을 입증하며 일반적으로 20 일 이내에 자발적인 수축을 나타낸다.
심장 마커 단백질은 또한 허혈성 그룹에서 성공적인 분화 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 전형적으로 MTT 애세에서 더 낮은 생존력을 나타내며, 노목성 대조군으로부터보다 낮은 수축성을 나타낸다. 프로피듐 요오드 양성 세포의 비율은 또한 허혈성 그룹에서 더 높으며, 대조군보다 세포 손상의 높은 발생률을 나타낸다. 심근세포의 수축성을 비교할 수 있도록 캡처 플레이트에 대한 관심 영역을 정확하게 찾는 것이 중요합니다.
이 기술은 환자 유래 iPS 세포를 사용하여 약물 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 또한 허혈성 심장 질환의 기본 메커니즘을 더욱 해명하기위한 독특한 플랫폼을 제공합니다.
