La reproducibilidad es una preocupación importante cuando se inducen cardiomiocitos derivados de células madre. Usando estos métodos, cardiomiocitos de alta pureza y alta calidad se pueden generar a partir de iPS para su uso en estudios funcionales. La principal ventaja de esta técnica es que es un método simple, fiable, rentable y extremadamente potente para obtener preparaciones purificadas y de alta calidad de cardiomiocitos derivados de iPSC.
Para el enjuague celular, enjuague las células con un mililitro de PBS sin calcio y magnesio durante siete a 10 minutos antes de reemplazar el PBS con un mililitro de medio de paso. Usando un elevador de células, raspe suavemente las células de la parte inferior de los pozos, y use una pipeta estéril de vidrio de dos mililitros para disociar mecánicamente las células separadas. Cuando las células se han levantado en pequeños racimos como visibles bajo el microscopio añadir medio de paso para dividir las células en una proporción de uno a seis.
A continuación, aspirar la matriz calificada de células madre embrionarias humanas a partir de la placa de seis pozos. Luego agregue un mililitro de medio de paso y un mililitro de células disociadas a cada pozo, y deje que las células crezcan hasta que alcancen 70 a 80% de confluencia antes de comenzar una diferenciación cardíaca. Al menos 30 minutos antes de disociar los iPSC-CM, limpie los resbalones individuales de la cubierta de vidrio con 70% de etanol y coloque los resbalones de la cubierta en pozos individuales de una placa estéril de seis pozos.
Cuando los resbalones de la cubierta se hayan secado, agregue una solución de matriz calificada de células madre embrionarias humanas de 250 a 300 microlitros de células madre embrionarias humanas directamente en el centro de cada resbalón de cubierta, y coloque la placa de seis pozos en la capucha de cultivo de tejido. Para disociar el iPSC-CM seleccionado metabólicamente añadir un mililitro de estéril 0.25%trypsin con EDTA a cada pozo para una incubación de cinco minutos a 35 grados centígrados, y utilizar una pipeta de 1000 microlitro para disociar mecánicamente las células hasta que se haya logrado una suspensión de una sola célula. Tire de las células en tubo cónico estéril de 15 mililitros, y lave cada pozo con dos mililitros de RPMI 20 medio por pozo.
Luego agregue los lavados al tubo y pelete las células por centrifugación. Resuspender las células en un volumen suficiente de medio para lograr un tres veces 10 a las quintas células por cada 250 microlitros de concentración de células. Utilice una punta de pipeta de 1000 mililitros para disociar las células hasta que la solución parezca homogénea.
A continuación, aspirar 250 microlitros de células en una punta de pipeta de 1000 microlitros, y dispensar lentamente todo el volumen de solución en una sola célula madre embrionaria humana calificada matriz codificada cubierta. Cuando todas las células hayan sido sembradas, coloque cuidadosamente la placa en la incubadora de cultivo celular durante la noche. Añadiendo suavemente dos mililitros de medio D7 a cada pozo a la mañana siguiente.
Cuando los iPSC-CM seleccionados alcancen al menos tres meses de edad tratar las células con dos microlitros de Fura-2 AM durante 10 minutos a 37 grados Celsius, y la energía en el sistema de análisis de calcio. Inicie el ArcLamp y conecte los tubos de la bomba a la entrada y salida apropiadas y el cable electrónico del estimulador a la cámara. Coloque la cámara en el sistema.
Llene el tubo ProFusion que atraviesa el calentador en línea fluido con la solución de Tyrode calentada de 37 grados Celsius, y ajuste las dimensiones de apertura de la cámara y el encuadre para minimizar el área de fondo. Fije la cubierta de vidrio sin semillas con iPSC-CM en la cámara, y agregue suavemente 500 microlitros de la solución de Tyrode directamente en la parte superior del resbalón de la cubierta. Comience a profusar la cámara con la solución de Tyrode a una velocidad de 1,5 mililitros por minuto, y utilice un estimulador eléctrico para el ritmo de los iPC-CM con 1 estimulación de campo Hertz a 10 voltios cada cuatro milisegundos durante tres a cinco minutos.
Cuando todo el tinte se haya lavado fuera de la cámara, ajuste la ventana de visualización a la región superior izquierda del resbalón de la cubierta y comience la grabación. Después de recoger una corriente consistente de cinco a 10 picos, haga clic en pausar para detener temporalmente la grabación y mover la etapa del microscopio a un área adyacente para el extremo opuesto del resbalón de la cubierta antes de reanudar la grabación. Después de escanear la transiencia de calcio a través de toda la cubierta, de la misma manera durante un período de 10 minutos, analice los datos con un software de análisis de trazas de florescencia adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Este protocolo genera cardiomiocitos altamente puros que adquieren un fenotipo ventricular, similar a un adulto en el cultivo con el tiempo. Según se evalúa mediante la tinción inmuno fluorescente para las isoformas MLC2 auriculares y ventriculares, la mayoría de las células generadas por este protocolo son isoformas MLC2 auriculares positivas en el día 30 después de la inducción de la diferenciación cardíaca. Mientras que las isoformas ventriculares MLC2 se expresan en muchos números al mismo punto de tiempo.
A medida que aumenta el tiempo en el cultivo, se observa un cambio completo a las isoformas MLC2. Estos datos también fueron confirmados por la cuantificación citométrica de flujo del porcentaje de células que expresan el marcador MLC2 auricular y ventricular. La amplitud del calcio aumenta significativamente en los iPSC-CM en el día 90, similar a la observada para los CM de ratas adultas.
Es importante tener en cuenta que las células no cardíacas contaminantes pueden influir en la maduración funcional de los iPSC-CM humanos durante la diferenciación. Además, cuando se registran transitorios de calcio en iPSC-CM es necesario permitir que las células se estabilicen a 37 grados Celsius bajo estimulación constante durante al menos 200 segundos, y restringir las grabaciones a una ventana de tiempo específica para garantizar resultados reproducibles. Recuerde confirmar que los iPSC exhiben una morfología homogénea y permitir que las células crezcan a 70 a 80% de confluencia antes de iniciar una diferenciación cardíaca.
La calidad pura en cardiomiocitos derivados de iPS inmaduros podría mostrar características funcionales alteradas, que no reflejan el fenotipo real, pero podrían ser malinterpretadas como el fenotipo enfermo. Por lo tanto, la obtención de cardiomiocitos puros y de alta calidad es importante para proporcionar resultados consistentes y reproducibles.
