La levadura es un organismo modelo popular, no sólo para estudios genéticos, sino también para estudios bioquímicos de proteínas y otras macromoléculas extraídas de cepas de tipo salvaje y de levadura mutante. Sin embargo, debido a sus paredes celulares resistentes, un desafío importante que los investigadores enfrentan es esta lysis eficiente de las células de levadura sin dañar el contenido celular. El aislamiento de macromoléculas biológicas intactas suele ser crítico, dependiendo de la temperatura.
La preparación de los extractos a baja temperatura garantiza que las proteasas y nucleasas intracelulares permanezcan inactivas, lo que resulta en un aislamiento confiable de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas para una lelisis suficiente. Varios métodos están disponibles para la obtención de extractos de levadura a través de la lysis enzimática, química y física. Sin embargo, la lysis enzimática es costosa debido a la necesidad de enzimas purificadas para digerir la pared celular, limitando así el uso de un menor número de células.
Además, las reacciones enzimáticas deben ser monitoreadas de cerca para prevenir la sobre digestión y la lysis prematura de las células. Los métodos químicos que utilizan agentes desnaturalizantes fuertes, aunque son eficaces, dan como resultado la desnaturalización de las proteínas y, como tales, no son adecuados para el aislamiento de complejos proteicos o enzimas funcionales. Los métodos físicos, como la lisis bajo alta presión en una prensa francesa, se pueden llevar a cabo en el frío a los cuatro grados centígrados, pero eso no es lo suficientemente frío como para evitar la degradación y la desnaturalización de todas las proteínas nativas.
Otros métodos físicos populares son el uso de un mortero y un mortero, licuadora o molinillo de café para moler las células de levadura resuspendidas en un tampón de lisis y congeladas como gotas o molienda y mezcla de cuentas de vidrio y levadura en un molino de batidor de cuentas de preparación rápida o una lisis por sonicación. Sin embargo, la molienda manual es intensiva en mano de obra y el rendimiento proteico resultante puede variar considerablemente dependiendo de las técnicas empleadas mientras que la lisis por sonicación o molienda en una licuadora, molinillo de café o molino de batidor de cuentas genera una cantidad sustancial de calor, lo que resulta en una desnaturalización y degradación de proteínas. Por lo tanto, para obtener lisis de células de levadura con proteínas en su estado nativo con una desnaturalización y degradación mínimas para aplicaciones como purificaciones de complejos proteicos funcionales, ensayos bioquímicos o detección de modificaciones post-traduccionales fugaces, es esencial utilizar un método de lisis fácilmente escalable que minimice la generación de calor al tiempo que permita una lisis eficiente independientemente de la cantidad de células.
Aquí describimos un método que implica el uso de un molino criogelante para la lisis de las células en nitrógeno líquido a menos 196 Celsius para generar extractos de células congeladas permitiendo así la recuperación de macromoléculas funcionales intactas, como proteínas o ADN y ARN, a temperaturas muy bajas que minimizan la desnaturalización y la degradación. Este método se puede adaptar fácilmente para su uso con cualquier tipo de muestra de célula o tejido de cualquier especie, incluyendo muestras forenses e incluso antiguas recuperadas de sitios arqueológicos o encontradas congeladas en permafrost. El molino congelador utiliza una cámara de molienda electromagnética superconductora que mueve rápidamente una barra de metal sólido hacia adelante y hacia atrás dentro de un archivo de policarbonato que contiene la muestra para pulverizar entre tapones de acero inoxidable.
Este método de lysis celular física permite una lysis más eficiente y resultados reproduciblemente en un extracto de mejor calidad. Las células de levadura se cultivaron a una concentración de 10 millones de células por mil. Estas células de levadura se colocaron en botella de centrífuga prefrinada y se hilaron durante 10 minutos a 2, 400 G.Una vez que el giro está completo, decantar el sobrenadante sin perturbar las células peletadas.
Este pellet fue resuspendido en una pequeña cantidad de agua helada, aproximadamente la mitad del volumen inicial del cultivo para lavar las células. Las células resuspendidas se giraron de nuevo durante otros 10 minutos a 2.400 G.Una vez que el siguiente giro está completo, nosotros, de nuevo, decantamos todo el sobrenadante sin alterar el pellet. Este pellet será resuspended y 15 ML de tampón de lyis helada.
Asegúrese de que el pellet esté completamente resuspendido. Las células resuspendidas deben permanecer sobre hielo en un tubo pre-marcado hasta que estén listas para el siguiente paso. Use siempre equipo de protección personal cuando manipule nitrógeno líquido, como gafas de seguridad, protección de manos y abrigos de laboratorio.
Para maximizar nuestra destreza, a menudo usamos un par de guantes térmicos blancos emparedados entre dos pares de guantes de nitrilo. Cambie los guantes exteriores y de nitrilo con frecuencia, ya que se rasgan fácilmente después de ser expuestos a nitrógeno líquido. En nuestro laboratorio, transferimos una alícuota de nitrógeno líquido a un pequeño contenedor de nitrógeno líquido de cinco litros.
El nitrógeno líquido se vierte en un tubo de 50 ML que se ha enfriado previamente sobre hielo seco. Una vez que el tubo de 50 ML está lleno de nitrógeno líquido, agregamos el extracto de levadura lentamente, de una manera prudente gota al tubo en incrementos de 1,5 mililitros. Para minimizar la formación de grandes pellets de palomitas de maíz, la suspensión de levadura se añade en un movimiento circular.
Para evitar aún más la formación de grandes pellets de palomitas de maíz, utilizamos grandes fórceps para asegurar que todos los pellets estén entre 0,3 y 0,5 centímetros de diámetro. Debido a que el nitrógeno líquido siempre se evapora, asegúrese de rellenar el tubo con nitrógeno líquido antes de agregar cada 1,5 mil alícuota de suspensión de levadura. Una vez que toda la suspensión de levadura se ha convertido en palomitas de maíz permitir que el tubo con palomitas de maíz se siente sin la tapa durante dos a tres minutos para dejar que todo el nitrógeno líquido residual se evapore.
Para estar seguro de que todo el nitrógeno líquido se ha evaporado, cierre la tapa casi por completo y agite suavemente. Si hay un silbido, indica que el nitrógeno líquido aún no se ha evaporado por completo. Abra la tapa durante un minuto más o menos para permitir que el nitrógeno líquido restante se evapore antes de cerrar la tapa firmemente.
El líquido residual en el tubo puede causar una explosión si la tapa se cierra prematuramente. Estas palomitas de maíz de levadura se pueden almacenar casi indefinidamente en menos 80 grados C.Para al menos cinco muestras, asegúrese de que tiene 30 a 35 litros de nitrógeno líquido disponibles. Llene el molino del congelador a la línea completa y cierre la tapa para permitir que el molino del congelador se precalfie durante unos minutos.
Una vez más, recuerde siempre usar equipo de protección personal cuando se trate con nitrógeno líquido. Los viales de molienda de policarbonato, los tapones de extremo de acero inoxidable y la barra del impactador deben enfriarse previamente con nitrógeno líquido. Mantenga estos componentes sumergidos hasta que el nitrógeno líquido deje de burbujear.
Recuerde mantener todas las muestras de palomitas de maíz en hielo seco hasta que se complete todo el proceso de molienda. Extraiga todo el nitrógeno líquido de los viales de molienda y transfiera sus palomitas de maíz al vial. No olvide colocar una barra de impactador magnético en el vial de molienda también.
Selle el vial de molienda colocando cuidadosamente el tapón de acero inoxidable uniformemente en el extremo del vial de molienda. Golpeamos cada extremo del vial de molienda en una placa de pan de madera con un respaldo de goma absorbente de vibraciones para asegurar que los tapones finales se colocan correctamente y están sellando los viales de molienda firmemente. Es importante asegurar los tapones finales para asegurarse de que no se sueltan y permitir que las muestras se derramen en el molino del congelador durante el proceso de molienda.
Coloque un vial de molienda en la cámara de molienda del molino congelador y fije en su lugar. Cierre la tapa del molino del congelador y muele la muestra durante tres ciclos a dos minutos por ciclo, a una velocidad de trituración de 14. Después de que los ciclos de molienda se completen desbloquear el vial con el lysate de la célula de polvo congelado.
Para evitar que el izado se descongele, trabaje rápida y cuidadosamente para desenroscar uno de los tapones finales con la herramienta de apertura. Una vez abierto el vial, retire la barra del impactador y transfiera rápidamente el extracto de polvo congelado en un plato de pesaje de plástico precalado. Recuperar la mayor parte del extracto congelado como sea posible golpeando el vial en la placa de madera.
Una vez que todo el polvo se retira del vial, transfiera rápidamente todos los extractos de polvo a un tubo preetiquetado de 15 mil mantenido en hielo seco. Aunque lo mejor es proceder con la descongelación y el uso de los extractos de inmediato para minimizar la degradación de la proteína, el lysate en polvo congelado se puede almacenar durante la noche en menos 80, si es necesario. Descongelar el polvo se desenfría lentamente en una suspensión de hielo que circula continuamente utilizando una barra de agitación magnética en un cubo de hielo.
Para facilitar incluso el descongelación, retire el hielo que se desarrolla en el exterior de los tubos con frecuencia, aproximadamente cada cinco minutos más o menos. Una vez que los extractos comienzan a descongelarse en un cóctel inhibidor de la proteasa 1X y 10 inhibidores del proteasoma micromolar MG132 para prevenir la degradación de las proteínas. Una vez que las muestras están completamente descongeladas, lo que puede tardar más de una hora, gire las muestras a 3, 220 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.
Este giro eliminará la mayoría de los desechos celulares del izado. Cuando el giro esté completo transfiera el sobrenadante a botellas de policarbonato que se hayan precalentado sobre hielo y deseche el pellet. Centrifugar el supernnato y las muestras a 16.000 G en cuatro grados Celsius durante 20 minutos para aclarar el extracto.
Una vez completado el giro, recupere sólo el sobrenadante transparente cuidadosamente desde el centro de la columna líquida sin alterar la capa turbia que contiene la pieza en la parte superior o los desechos peletados en la parte inferior del tubo centrífugo. Transfiera el izado transparente en un tubo de 15 Mil precalinado. El líquido nublado restante se puede actualizar durante cinco minutos a la misma velocidad para permitir la recuperación de algunos más del lysate al por mayor.
Los extractos ya están listos para su uso en experimentos, como la purificación de complejos proteicos y la inmunoprecipitación. Comparamos dos métodos diferentes de lysis de células de levadura, a saber, el fresado de cuentas de vidrio a cuatro grados Celsius y un método automatizado de molienda criogénica en menos 196 Celsius para evaluar las proteínas recuperadas relativas y los extractos celulares preparados con ambos métodos. A partir de este estudio elegimos utilizar una cepa de levadura en ciernes que lleva un plásmido de copia alta que expresa un tándem HIS-MYC etiquetado ubiquitina.
Así que podemos evaluar la afinidad de la recuperación de proteínas poliubiquitinadas etiquetadas a partir de extractos al por mayor, después de la purificación de afinidad utilizando cuentas de afinidad de etiqueta TALON cobalto HIS seguidas de hinchazón occidental con un anticuerpo monoclonal HIS tag. Proteínas poliubiquitinas que normalmente son muy efímeras debido a su rápida degradación por la maquinaria proteosoma de ubiquitina y por lo tanto ofrecen una muy buena manera de comparar la calidad de los extractos al por mayor preparados por diferentes métodos. Como vemos en la mitad derecha de la membrana teñida de Ponceau, recuperamos un mayor rendimiento total de proteínas en los extractos al por mayor preparados por el protocolo de molino crioelédizar como se juzgó por la tinción más intensiva de Ponceau en todo el carril de extracto al por mayor.
Esto es especialmente claro en las partes inferior y superior del molino congelador carriles enteros de extractos. Además, como se muestra en la mitad derecha de la etiqueta HIS Western blot, observamos una mejor recuperación de la proteína ubiquitinada de la etiqueta HIS-MYC seguida de tirar hacia abajo usando cuentas de Talon de los extractos al por mayor preparados por la molienda criogénica. Concluimos que el molino congelador criogénico es superior a otros métodos para la preparación de extractos celulares, especialmente cuando se requieren macromoléculas funcionales para la aplicación posterior.
