Los estudios estructurales de proteínas que interactúan con microtúbulos mediante microscopía crioelectrónica son cruciales para comprender los mecanismos celulares. La preparación de microtúbulos homogéneos unidos a proteínas que interactúan en una rejilla crio-EM es crucial para el éxito. Este protocolo es simple, barato y permite preparar microtúbulos con modificaciones post-traduccionales controladas en cantidad y calidad suficientes para la microscopía crioelectrónica.
Los microtúbulos son muy sensibles a la temperatura. Por lo tanto, es importante mantener calientes las soluciones que contienen microtúbulos para evitar la despolimerización. Para comenzar, cultivo de línea celular HCT116 modificada genéticamente en medio de cultivo celular DMEM hasta obtener de seis a 12 placas confluentes.
Lave las células suavemente con 10 mililitros de PBS para eliminar cualquier medio de cultivo celular. Separe las células de las placas incubando las células durante cinco minutos a temperatura ambiente con tres mililitros de PBS helado complementado con EDTA de cinco milimolares y, posteriormente, utilizando un raspador celular. Recoja las células en un tubo de 50 mililitros sobre hielo y gire a 250 G durante 10 minutos.
Tenga en cuenta el volumen de las células cosechadas con la escala volumétrica en el tubo. Resuspender el pellet de células cosechadas en un volumen igual de tampón de lisis y células de lisis por sonicación. Después de la sonicación, para el análisis SDS-PAGE, agregue dos microlitros de lisado en un tubo que contenga 18 microlitros de agua y cinco microlitros de tampón de muestra 5X SDS.
Pipetear las células lisadas restantes en un tubo de centrífuga y girar a 100.000 G durante una hora a cuatro grados centígrados en un rotor de ultracentrífuga para eliminar el lisado. Con una jeringa, retire el lisado aclarado sin alterar el pellet y la capa flotante en la parte superior. Agregue dos microlitros de lisado aclarado en un tubo que contenga 18 microlitros de agua y cinco microlitros de tampón de muestra 5X SDS.
Enjuague cuidadosamente el pellet y recoja un poco del pellet girando una punta de pipeta P-10 a través del pellet. Luego, agregue 200 microlitros de agua y 50 microlitros de tampón SDS. Agregue un GTP milimolar y 20 micromolares de paclitaxel en un sobrenadante recolectado para polimerizar los microtúbulos e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos para permitir que los microtúbulos se ensamblen.
Prepare el amortiguador de amortiguación agregando 600 microlitros de glicerol a 400 microlitros de tampón de lisis y complemente la mezcla con 20 micromolares de paclitaxel. Precaliente el amortiguador a 37 grados centígrados. Agregue 800 microlitros de amortiguador de amortiguación a un tubo de ultracentrífuga.
A continuación, pipetear el lisado suplementado con GTP-paclitaxel con cuidado sobre el tampón del cojín. Coloque el tubo en un rotor ultracentrífugo para girar a 100, 000 G a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Marque el borde exterior del tubo para reconocer fácilmente dónde debe formarse el pellet de microtúbulos.
Después de la centrifugación, retire el amortiguador con cuidado con una pipeta sin alterar el pellet. Agregue cuidadosamente el tampón de lisis junto al pellet, gire el tubo varias veces para eliminar la mayor cantidad de glicerol posible del pellet y las paredes del tubo, y luego aspire y repita el paso de lavado tres veces. Resuspender suavemente el pellet lavado con una punta cortada en tampón de resuspensión precalentado de 50 microlitros y colocar el tubo a 37 grados centígrados.
Agregue dos microlitros de fracción de pellet resuspendida en 18 microlitros de agua y cinco microlitros de tampón de muestra 5X SDS. Prepare el dispositivo congelador de inmersión instalando el papel secante. Ajuste la temperatura del dispositivo a 30 grados centígrados y la humidificación al 100%Permita que el dispositivo se equilibre durante 30 minutos.
Prepare los ajustes del congelador de inmersión para dos aplicaciones. Para la primera aplicación, establezca la fuerza en 10, dos segundos de tiempo de borrado y cero segundos de tiempo de espera. Para la segunda aplicación, establezca la fuerza en 10, 6,5 segundos de tiempo de borrado y 10 segundos de tiempo de espera.
Coloque las rejillas con su lado de carbono hacia arriba en el vehículo descargador de metal incandescente. La descarga incandescente de la microscopía crioelectrónica, o rejillas EM, a 30 miliamperios durante 60 segundos. Enfríe el conjunto del recipiente de poliestireno con nitrógeno líquido y prepare etano líquido en una taza de metal condensando el gas etano en una taza de metal fría.
Diluir la proteína que interactúa con los microtúbulos en igual volumen con tampón de dilución antes de aplicarla a las rejillas para reducir la concentración celular. Coloque la batidora a 37 grados centígrados. Use un bloque de metal caliente en una caja de poliestireno aislante si no hay un bloque de calentamiento cerca del dispositivo de congelación por inmersión.
Tome una rejilla descargada de brillo con pinzas de inmersión y haga clic en el congelador de inmersión. Coloque el recipiente de poliestireno con etano líquido en el congelador de inmersión y ejecute el programa preparado. Primero, aplique 3.5 microlitros de solución de microtúbulos a la rejilla.
Deje que el congelador de inmersión borre la rejilla. Luego, aplique inmediatamente 3.5 microlitros de proteína diluida. Y, por último, deje que el émbolo se seque y la inmersión congele la rejilla en etano líquido.
Transfiera las rejillas a una caja de almacenamiento de red y guárdelas en un Dewar de nitrógeno líquido hasta que se obtengan imágenes. La calidad y la concentración de los microtúbulos extraídos se evaluaron mediante gel SDS teñido con Coomassie. Una línea de regresión no lineal de las cantidades relativas de BSA, derivada de la interpolación de la banda de microtúbulos alrededor de 50 kilodalton en el carril P2 con la curva BSA, indica una concentración final de 1,42 miligramos por mililitro.
Esto concuerda bien con el número medido con un espectrofotómetro por dos personas. Los microtúbulos recién extraídos se utilizaron para hacer muestras crio-EM. Los microtúbulos se ven intactos y abundantes en las micrografías.
La densidad de microtúbulos por micrografía no debe ser demasiado alta para evitar que los microtúbulos se crucen entre sí. Los microtúbulos rotos indican que los microtúbulos están despolimerizados, o que la concentración de microtúbulos era demasiado densa. Los microtúbulos unidos a MATCAP tenían bordes ásperos caracterizados por puntos densos en electrones en la superficie de los microtúbulos.
Los microtúbulos no unidos a MATCAP y no unidos a MATCAP también podrían distinguirse en las clases 2D calculadas. Hacer rejillas crio-EM con este método puede permitir estudiar la estructura de los microtúbulos unidos a una proteína específica que interactúa. Esto puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos en la biología celular estructural.
