Este protocolo funciona con muestras de corazones humanos y animales, incluso después de horas de transporte. Se pueden aislar hasta 200 miocitos por miligramo de las rodajas de tejido cortados con vibratome. El análisis electrofisiológico, estructural y bioquímico de los cardiomiocitos, ayuda a descubrir y comprender mejor los mecanismos de la enfermedad cardíaca.
Después de llenar un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros, con 20 mililitros de solución de corte en frío, coloque la muestra de tejido en el plato de cultivo. Mantenga el plato de cultivo en un plato enfriado a 4 grados Celsius. Tenga en cuenta que las muestras de tejido vivo de animales y especialmente de los seres humanos son potencialmente infecciosas.
Use tijeras o bisturí, para eliminar el exceso de tejido fibroso y grasa epicardial, de la muestra. Para un procesamiento óptimo del vibratoma de muestras de tejido más grandes, utilice el bisturí para cortar cubos de ocho milímetros del tejido. Para muestras más pequeñas de biopsias, esto no es necesario.
Se puede identificar el epicardium por la capa de grasa epicardial. Después de eliminar el exceso de grasa, coloque el bloque de tejido, en el plato, con el epicardium hacia abajo. Para prepararse para la incrustación de tejido, hierva 400 miligramos de baja agarosa de punto de fusión en diez mililitros de solución de corte.
Llene una jeringa de diez mililitros con el gel de agarosa disuelto en caliente. Selle la jeringa y colóquela en un baño de agua de 37 grados Centígrados durante al menos 15 minutos, para permitir que la agarosa se equilibre. Usando fórceps, mueva la muestra de recorte en un plato limpio de cultivo de tejido de 35 milímetros, con el epicardium hacia abajo.
A continuación, retire el exceso de líquido de la muestra, con un hisopo estéril. Asegure el espécimen contra el movimiento, sosteniéndolo con fórceps. Y vacíe la jeringa de agarosa encima de ella, asegurándose de sumergir completamente el espécimen.
Inmediatamente colocó el plato sobre hielo y dejar que la agarosa se solidifique durante 10 minutos. Monte una cuchilla de afeitar sin usar en el soporte de la hoja del vibratomo. Si es posible, calibrar el vibratomo, ajustando la desviación Z de la cuchilla.
Usa un bisturí para extirpar un bloque de tejido de agarosa que se ajuste al soporte de la muestra del vibratoma. Para garantizar la estabilidad, asegúrese de que el tejido esté suficientemente sumergido en agarosa. Con márgenes de agarosa, de al menos ocho milímetros.
Aplique una fina capa de pegamento de cianoacrilato al soporte de la muestra. Y presione suavemente el bloque de tejido de agarosa, sobre el soporte. Construir un baño vibratomo, con solución de corte.
A continuación, llenar el tanque de enfriamiento exterior del vibratome con hielo triturado, para mantener una temperatura de cuatro a seis grados centígrados, durante todo el proceso de corte. Coloque el soporte de la muestra, que contiene el bloque de tejido de agarosa, en el baño del vibratomo. Usando los ajustes de vibratoma descritos en el manuscrito, genere cortes de 300 microlitros de espesor.
Es crucial crear secciones en epicardio paralelo porque así es como las fibras cardiomiocitos se alinean en la pared ventricular. De lo contrario, habrá demasiado daño. Utilice un microscopio de luz estándar, para comprobar la alineación de los cardiomiocitos y las rebanadas de tejido.
Para evitar dañar el tejido, sostenga la agarosa, en lugar del tejido en sí. Las fibras de cardiomiocitos deben estar alineadas uniformemente y los miocitos, no deben contraerse. Coloque una placa de calor en la coctelera de laboratorio y calientela a 37 grados centígrados.
Encienda el agitador de laboratorio a 65 RPM. Disolver la proteinasa en dos mililitros de solución uno. Y disolver la colagenasa, en dos mililitros de solución uno.
Pero no mezcle la proteinasa y la colagenasa. Añadir cloruro de calcio a la solución de colagenasa, para una concentración final, de cinco micromolares. Incubar ambas soluciones a 37 grados centígrados.
Use fórceps para transferir una rebanada de tejido a un plato limpio de cultivo de tejido de 60 milímetros. Con cinco milímetros de solución de corte pre-refrigerada. Manteniendo el plato en hielo o en un plato frío, retire cuidadosamente la agarosa del tejido, usando una cuchilla o fórceps.
Para realizar el lavado inicial de las rodajas de tejido, coloque un plato limpio de cultivo de tejido de 35 milímetros en la hoja de calor. Y llénalo, con dos milímetros de solución precale calentada uno. Transfiera una o dos rodajas de tejido al plato preparado.
A continuación, utilice una pipeta de un milímetro para los pasos de lavado. Después de lavar las rodajas, retire la solución uno del plato y agregue dos mililitros de la solución proteasa. Incubar las rodajas durante 12 minutos en la cuchilla de calor, con la coctelera a 65 RPM.
Lave las rodajas de tejido dos veces más, con dos mililitros de solución precalentó una. A continuación, retire la solución uno del plato y agregue dos mililitros de solución de colagenasa. Incubar las rodajas durante al menos 30 minutos en la hoja de calor, con agitación a 65 RPM.
Después de 15 minutos de incubación, compruebe si hay miocitos individuales gratuitos, examinando el plato bajo un microscopio ligero. Continúe revisando cada cinco minutos, hasta que los miocitos individuales sean visibles. Luego, la digestión alt lavando las rodajas dos veces, con dos mililitros de solución precalentó dos.
Y rellene el plato, con dos mililitros de solución dos. Tire con cuidado de las fibras de la rebanada de tejido, utilizando fórceps finos. Continúe trabajando con cuidado, para evitar dañar los cardiomiocitos.
Y pipeta varias veces, con un solo uso más allá de su pipeta. Luego, confirme que los cardiomiocitos en forma de varilla se han separado, examinando el plato, bajo un microscopio de luz. Coloque el plato de nuevo en la placa de calor a 37 grados Celsius y agitar agitando.
Mediante la adición de soluciones de 10 milimolar y 100 soluciones de uroquita de cloruro de calcio milimolar, aumentar lentamente la concentración de calcio de la suspensión de tejido de cinco micromolares a 1,5 milimolar. Cuando el aumento de calcio se haya completado, use fórceps para eliminar los trozos de tejido no digeridos restantes. En primer lugar, detenga la agitación de la suspensión.
A continuación, con una pipeta de 1000 microlitro, retire lentamente 1/3 de la solución, de la parte superior de la suspensión. Evitar la aspiración de los cardiomiocitos. Luego agregue 700 microlitros de la solución tres, a las células.
Después de 10 minutos de agitación, repita estos pasos de lavado. Transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Y permitir que los cardiomiocitos sedimentar a temperatura ambiente, durante un mínimo de 10 minutos y un máximo de 30 minutos.
Retire el sobrenadante por completo. Y resuspender el pellet en solución de tiro modificado o el buffer de experimentación deseado. Con un microscopio de luz, verifique la calidad de la célula.
30 a 50%de los cardiomiocitos deben tener forma de varilla, lisa sin manchas de membrana. Y muestra, claras estrías cruzadas. Para verificar la eficiencia de aislamiento, el protocolo se aplicó al miocardio de rata.
Y en comparación con el aislamiento a través de la perfusión coronaria y el aislamiento, de pequeños trozos de tejido. Se observó una menor proporción de células en forma de varilla cuando se utiliza el protocolo, luego después del aislamiento por perfusión. Pero el número total seguía siendo alto.
Por el contrario, el aislamiento de los trozos de tejido produjo menos células en forma de varilla. La citometría de flujo, se utilizó para comparar los resultados cuantitativamente. El aislamiento de los cardiomiocitos de las rodajas de tejido, no alcanza el rendimiento obtenido por perfusión coronaria.
Pero proporciona rendimientos significativamente más altos que el aislamiento de miocitos, de trozos de tejido. A continuación, el protocolo se aplicó al miocardio humano. El aislamiento de las rodajas de miocardio, produjo números de Hyde y una gran proporción de miocitos humanos en forma de varilla.
Y sólo una pequeña proporción de cardiomiocitos redondeados. El aislamiento de las rodajas de miocardio, resultó en un número sorprendentemente mayor de miocitos en forma de varilla, que el aislamiento de trozos de tejido. La cuantificación fotométrica confirmó una viabilidad de miocitos sustancialmente mayor después del aislamiento de las rodajas de miocárdico.
Las células humanas, aisladas con el protocolo descrito, pueden ser sometidas a análisis estructurales. La tinción de actinina alfa, reveló un patrón de línea Z regular denso y una longitud media de sarcomere de 1,92 micrómetros, en cardiomiocitos en reposo. Tinción LTCC y RyR, muestra racimo claro está co-localizado cerca de la membrana celular y los túbulos T.
Los cardiomiocitos aislados eran excitables y podían utilizarse para estudios sobre electrofisiología celular o acoplamiento de contracción de excitación. Potencial de acción forma y duración, estaba en el rango reportado por otros, para cardiomiocitos ventriculares, de corazones humanos fallidos. Los transitorios de calcio grabados por Khan vocal line scanning, mostraron un claro upstroke después de la estimulación.
Y, una relación señal-ruido aceptable. El acortamiento de cardiomiocitos por contracción se puede ver a partir de la desviación del borde inferior de la célula. Debido al alto número de aisladores cardiomiocitos obtenidos por este protocolo, el cultivo celular es posible.
Esto puede permitir la transferencia de genes, las pruebas farmacológicas y la ingeniería de tejidos de los cardiomiocitos humanos. Una aplicación importante.es la verificación de hallazgos.de modelos animales en células humanas. La insuficiencia cardíaca es un síndrome clínico con opciones terapéuticas muy limitadas.
Las técnicas mejoradas de aislamiento de cardiomiocitos ayudarán a identificar dianas celulares para el diagnóstico y futuras terapias.
