يعمل هذا البروتوكول مع عينات من قلوب الإنسان والحيوان، حتى بعد ساعات من وقت النقل. يمكن عزل ما يصل إلى 200 myocytes لكل ملليغرام من شرائح الأنسجة التي تقطع الاهتزاز. التحليل الكهربائي والإنشائي والبيوكيميائي لـ Cardiomyocytes، يساعد على اكتشاف آليات أمراض القلب وفهمها بشكل أفضل.
بعد ملء 100 ملليمتر طبق ثقافة الأنسجة، مع 20 ملليلتر من محلول القطع الباردة، ووضع عينة الأنسجة في طبق الثقافة. الحفاظ على طبق الثقافة على لوحة تبريدها إلى 4 درجات مئوية. نضع في اعتبارنا أن عينات الأنسجة الحية من الحيوانات وخاصة البشر يحتمل أن تكون معدية.
استخدام مقص أو مشرط، لإزالة الأنسجة الليفية الزائدة والدهون الايكليفية، من العينة. لمعالجة الاهتزاز الأمثل لعينات الأنسجة الكبيرة، استخدم المشرط لقطع مكعبات ثمانية ملليمترات من الأنسجة. بالنسبة للعينات الأصغر من الخزعات ، وهذا ليس ضروريًا.
يمكن للمرء أن يحدد epicardium من طبقة الدهون epicardial. بعد إزالة الدهون الزائدة، ضع كتلة الأنسجة، في الطبق، مع epicardium تواجه أسفل. للتحضير لتضمين الأنسجة، قم بغلي 400 ملليغرام من انخفاض درجة ذوبان الأذان في عشرة ملليلترات من محلول القطع.
ملء حقنة 10 ملليلتر مع هلام agarose المذابة الساخنة. ختم الحقنة ووضعها في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل، للسماح agarose لتكواسير. باستخدام ملقط، نقل عينة تقليم في طبق نظيف ثقافة الأنسجة 35 ملليمتر، مع epicardium التي تواجهها إلى أسفل.
ثم، إزالة السوائل الزائدة من العينة، مع مسحة معقمة. تأمين العينة ضد الحركة، من خلال عقد مع ملقط. وإفراغ حقنة agarose على أعلى منه، مع التأكد من أن تزج تماما العينة.
على الفور وضع الطبق على الجليد والسماح لأغاروز ترسيخ لمدة 10 دقائق. قم بتركيب شفرة حلاقة غير مستخدمة إلى حامل الشفرة من الاهتزاز. إذا كان ذلك ممكنا، معايرة هزاز، عن طريق ضبط انحراف Z من النصل.
استخدام مشرط لمعالجة كتلة الأنسجة agarose التي تناسب حامل العينة من هزاز. لضمان الاستقرار، تأكد من أن الأنسجة لا تزال مغمورة بما فيه الكفاية في agarose. بهوامش أجاروز، لا تقل عن ثمانية ملليمترات.
تطبيق طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلا على حامل العينة. واضغط بلطف على كتلة الأنسجة agarose، على حامل. بناء حمام هزاز، مع حل القطع.
ثم، ملء خزان التبريد الخارجي من هزاز مع الجليد سحقت، للحفاظ على درجة حرارة من أربع إلى ست درجات مئوية، في جميع أنحاء عملية القطع. ضع حامل العينة، الذي يحتوي على كتلة الأنسجة agarose، في حمام الاهتزاز. باستخدام إعدادات الاهتزاز الموصوفة في المخطوطة، قم بتوليد 300 شريحة سميكة ميكروليتر.
من الأهمية بمكان إنشاء أقسام في epicardium متوازي لأن هذه هي الطريقة التي يتم محاذاة ألياف القلب في البطين. وإلا، سيكون هناك الكثير من الضرر. استخدام مجهر ضوء قياسي، للتحقق من محاذاة القلب وشرائح الأنسجة.
لتجنب إتلاف الأنسجة، عقد agarose، بدلا من الأنسجة نفسها. وينبغي أن تكون ألياف cardiomyocyte ، موحدة ومحاذاة myocytes ، لا ينبغي التعاقد. ضع صفيحة حرارية على شاكر المختبر وسخّنها إلى 37 درجة مئوية.
بدء شاكر المختبر في 65 دورة في الدقيقة. تذوب البروتينات في مليلترين من الحل واحد. وتذوب الكولاجيناز، في مليلترين من الحل واحد.
ولكن لا تخلط البروتينات والكولاجيناز. إضافة كلوريد الكالسيوم إلى محلول الكولاجيناز، لتركيز النهائي، من خمسة ميكرومولار. احتضان كلا الحلين في 37 درجة مئوية.
استخدام ملقط لنقل شريحة الأنسجة إلى نظيفة 60 ملليمتر طبق زراعة الأنسجة. مع خمسة ملليمترات من محلول القطع المبردة مسبقًا. الحفاظ على الطبق على الجليد أو لوحة باردة، وإزالة بعناية agarose من الأنسجة، وذلك باستخدام شفرة أو ملقط.
لإجراء الغسيل الأولي لشرائح الأنسجة، ضع طبقًا نظيفًا لثقافة الأنسجة 35 ملليمترًا على شفرة الحرارة. وملئه، مع مليمترين من محلول ما قبل الدفء واحد. نقل واحد أو اثنين من شرائح الأنسجة إلى الطبق المعدة.
ثم استخدام ماصة ملليمتر واحد، للخطوات الغسيل. بعد غسل الشرائح، وإزالة حل واحد من الطبق وإضافة ملليلتر من محلول البروتينات. احتضان الشرائح لمدة 12 دقيقة على شفرة الحرارة، مع شاكر في 65 دورة في الدقيقة.
غسل شرائح الأنسجة مرتين أكثر، مع ملليلترين من محلول ما قبل الدفء واحد. بعد ذلك، إزالة حل واحد من الطبق وإضافة ملليلتر من محلول الكولاجيناز. احتضان شرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل على شفرة الحرارة، مع اهتزاز في 65 دورة في الدقيقة.
بعد 15 دقيقة من الحضانة ، تحقق من وجود myocytes الفردية المجانية ، عن طريق فحص الطبق تحت مجهر خفيف. تابع التحقق كل خمس دقائق، حتى تصبح الخلايا myocytes الفردية مرئية. ثم، الهضم البديل عن طريق غسل شرائح مرتين، مع ملليلتر اثنين من محلول ما قبل الدافئة اثنين.
وإعادة ملء الطبق، مع مليلترين من الحل الثاني. سحب بعناية ألياف شريحة الأنسجة وبصرف النظر، وذلك باستخدام ملقط غرامة. مواصلة العمل بعناية، لتجنب إتلاف عضلة القلب.
وماصة عدة مرات، مع استخدام واحد الماضي ماصة الخاص بك. ثم، تأكد من أن cardiomyocytes على شكل قضيب قد فصلت، من خلال فحص الطبق، تحت مجهر خفيف. وضع الطبق مرة أخرى على لوحة الحرارة في 37 درجة مئوية وتهيج عن طريق هز.
بإضافة 10 ملليمولار و 100 ميلليمولار كلوريد كلوريد المحالل، زيادة تركيز الكالسيوم ببطء من تعليق الأنسجة من خمسة ميكرومولار إلى 1.5 ميليمولار. عندما يكون زيادة الكالسيوم كاملة، واستخدام ملقط لإزالة أي قطع الأنسجة غير المهضومة المتبقية. أولاً، أوقفوا هياج التعليق.
بعد ذلك، باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، إزالة ببطء 1/3 من الحل، من أعلى التعليق. تجنب طموح عضلة القلب. ثم إضافة 700 ميكرولترات من الحل ثلاثة، إلى الخلايا.
بعد 10 دقائق من الانفعالات، كرر خطوات الغسيل هذه. نقل التعليق إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر. والسماح للقلب العضلي إلى الرواسب في درجة حرارة الغرفة، لمدة 10 دقائق كحد أدنى والحد الأقصى من 30 دقيقة.
إزالة ناظر تماما. وإعادة تعليق بيليه في حل التيرود المعدلة أو المخزن المؤقت التجريب المطلوب. باستخدام المجهر الخفيف، تحقق من جودة الخلية.
30 إلى 50٪ من cardiomyocytes ينبغي أن تكون على شكل قضيب، على نحو سلس دون غشاء blebs. وعرض، مسح التصدعات عبر. للتحقق من كفاءة العزل، تم تطبيق البروتوكول على فئران القلب.
وبالمقارنة مع العزلة عن طريق الضخ التاجي والعزلة، من قطع الأنسجة الصغيرة. لوحظت نسبة أقل من الخلايا على شكل قضيب عند استخدام البروتوكول، ثم بعد العزل عن طريق التسريب. لكن العدد الإجمالي كان لا يزال مرتفعاً.
في المقابل، العزلة عن قطع الأنسجة، أسفرت عن عدد أقل من الخلايا على شكل قضيب. تدفق cytometry، وكان يستخدم لمقارنة النتائج كميا. عزل عضلة القلب من شرائح الأنسجة، لا تصل إلى العائد التي حصل عليها الضخ التاجي.
ولكن يوفر، عائدات أعلى بكثير من عزل myocyte، من قطع الأنسجة. بعد ذلك، تم تطبيق البروتوكول على عضلة القلب البشرية. العزلة عن شرائح عضلة القلب ، أسفرت عن أرقام هايد ونسبة كبيرة من الخلايا myocytes على شكل قضيب الإنسان.
وفقط نسبة صغيرة من, تقريب عضلة القلب. العزلة عن شرائح عضلة القلب ، أدت إلى عدد أكبر بشكل لافت للنظر من الخلايا myocytes على شكل قضيب ، من العزلة عن قطع الأنسجة. وأكد القياس الكمي الضوئي قدرة أكبر بكثير على البقاء myocyte بعد العزل من شرائح عضلة القلب.
الخلايا البشرية، المعزولة مع البروتوكول الموصوف، يمكن أن تخضع للتحليل الهيكلي. ألفا actinin تلطيخ, كشفت عن نمط خط Z العادية الكثيفة ومتوسط طول ساركومير من 1.92 ميكرومتر, في عضلة القلب يستريح. LTCC وRyR تلطيخ، وأظهرت كتلة واضحة هو شارك في ترجمة بالقرب من غشاء الخلية وتي tubules.
كانت خلايا القلب المعزولة قابلة للإثارة ويمكن استخدامها لإجراء دراسات حول الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية أو اقتران انكماش الإثارة. عمل شكل محتمل ومدة, كان في المدى أفاد بأخرى, لبطينيّ عضلة القلب, من يخفق قلوب إنسانيّة. وأظهرت العابرين الكالسيوم التي سجلتها خان خط صوتي المسح الضوئي، ضربة قوية واضحة بعد التحفيز.
و، إشارة مقبولة إلى نسبة الضوضاء. يمكن رؤية تقصير القلب من خلال الانكماش من انحراف حدود الخلية السفلية. بسبب العدد الكبير من المعزولة cardiomyocytes التي تم الحصول عليها من قبل هذا البروتوكول، خلية الثقافة ممكن.
وهذا قد يسمح لنقل الجينات، والاختبار الدوائي وهندسة الأنسجة من خلايا القلب البشري. تطبيق مهمّة, التحقق من استنتاجات, من نماذج في خلايا إنسانيّة. فشل القلب هو متلازمة سريرية مع خيارات علاجية محدودة جدا.
سوف تساعد تقنيات عزل القلب العضلي الوعائي المحسنة على تحديد الأهداف الخلوية للتشخيص والعلاجات المستقبلية.
