Этот протокол работает с образцами из сердца человека и животных, даже после нескольких часов времени транспортировки. До 200 миоцитов на миллиграмм можно изолировать от ломтиков ткани, разрезанной вибратомом. Электрофизиологический, структурный и биохимический анализ кардиомиоцитов, помогает обнаружить и лучше понять механизмы сердечных заболеваний.
После заполнения 100-миллиметровой ткани культуры блюдо, с 20 миллилитров холодного раствора резки, место образца ткани в культуре блюдо. Держите блюдо культуры на тарелке охлаждается до 4 градусов по Цельсию. Имейте в виду, что образцы живой ткани у животных и особенно людей потенциально заразны.
Используйте ножницы или скальпель, чтобы удалить избыток фиброзной ткани и эпикардиального жира, из образца. Для оптимальной обработки вибромы больших образцов тканей используйте скальпель, чтобы вырезать из ткани восемь миллиметров кубиков. Для небольших образцов биопсии в этом нет необходимости.
Эпикардиум можно определить по эпикардиального жировому слою. После удаления лишнего жира, поместите блок ткани, в блюдо, с эпикардием лицом вниз. Чтобы подготовиться к встраиванию тканей, варите 400 миллиграммов низкой точки плавления агарозы в десяти миллилитров режущей раствора.
Заполните десятимилитрный шприц горячим растворенным гелем агарозы. Печать шприца и поместите его в 37 градусов по Цельсию водяной бане, по крайней мере 15 минут, чтобы агароза эквилибрировать. Используя миппы, переместите образец отделки в чистое 35-миллиметровое блюдо культуры тканей, с эпикардием лицом вниз.
Затем удалите излишки жидкости из образца, с помощью стерильного тампона. Защитите образец от движения, удерживая его щипец. И опорожните шприц агарозы поверх него, убедившись, что полностью погрузить образец.
Сразу же вы разместили блюдо на льду и дайте агарозе затвердеть в течение 10 минут. Намонтировать неиспользованное лезвие бритвы к держателю лезвия вибромы. Если это возможно, откалибровать вибром, путем регулировки отклонения от лезвия.
Используйте скальпель, чтобы выдать блок ткани агарозы, который подходит держатель образца вибромы. Для обеспечения стабильности убедитесь, что ткань по-прежнему достаточно погружена в агарозу. С полями агарозы, по крайней мере восемь миллиметров.
Нанесите тонкий слой клея цианоакрилата на держатель образца. И осторожно нажмите блок ткани агарозы, на держатель. Постройте вибромную ванну с раствором для резки.
Затем заполните внешний резервуар охлаждения вибромы дробленым льдом, чтобы поддерживать температуру от четырех до шести градусов по Цельсию, на протяжении всего процесса резки. Поместите держатель образца, содержащий блок ткани агарозы, в ванну с вибромой. Используя настройки вибромы, описанные в рукописи, генерируйте 300 микролитров толстых ломтиков.
Очень важно создать разделы в параллельном эпикардии, потому что это, как кардиомиоцитов волокна выровнены в желудочковой стенке. В противном случае, будет слишком много повреждений. Используйте стандартный световой микроскоп, чтобы проверить выравнивание кардиомиоцитов и ломтиков ткани.
Чтобы не повредить ткани, держите агарозу, а не сам ткань. Кардиомиоцитные волокна, должны быть равномерно выровнены и миоциты, не должны быть заключены контракты. Поместите тепловую пластину на лабораторный шейкер и разогрейте ее до 37 градусов по Цельсию.
Запустите лабораторный шейкер при 65 об/мин. Растворите протеиназу в двух миллилитров раствора один. И растворить коллагеназу, в двух миллилитров раствора один.
Но не смешивайте протеиназу и коллагеназу. Добавьте хлорид кальция в раствор коллагеназы, для окончательной концентрации, из пяти микромоляров. Инкубировать оба решения при 37 градусах по Цельсию.
Используйте типсы для переноса ломтика ткани в чистую 60-миллиметровую культурную тарелку. С пятью миллиметрами предварительно охлажденного раствора для резки. Сохраняя блюдо на льду или холодной тарелке, аккуратно извлекаем агарозу из ткани, используя лезвие или типсы.
Для выполнения первоначального мытья тканей ломтиками, поместите чистую 35-миллиметровую ткань культуры блюдо на тепловом лезвии. И заполнить его, с двумя миллиметрами предварительно разогретый раствор один. Перенесите один или два ломтика ткани в приготовленное блюдо.
Затем используйте одномиллиметровую пипетку для мытья ступеней. После мытья ломтиков, удалить раствор один из блюда и добавить два миллилитров раствора протеиназы. Инкубировать ломтики в течение 12 минут на тепловом лезвии, со шейкером при 65 об/мин.
Вымойте ткани ломтиками в два раза больше, с двумя миллилитров предварительно разогретого раствора один. Затем удалите раствор один из блюда и добавьте два миллилитров раствора коллагеназы. Инкубировать ломтики, по крайней мере 30 минут на тепловом лезвии, с тряской при 65 об/мин.
После 15 минут инкубации, проверьте бесплатно отдельных миоцитов, изучая блюдо под легким микроскопом. Продолжайте проверять каждые пять минут, пока не будут видны отдельные миоциты. Затем, alt пищеварения путем мытья ломтиков в два раза, с двумя миллилитров предварительно разогретого раствора два.
И пополнить блюдо, с двумя миллилитров раствора два. Аккуратно потяните волокна ткани ломтиком друг от друга, используя тонкие миппы. Продолжайте работать осторожно, чтобы избежать повреждения кардиомиоцитов.
И пипетка несколько раз, с одним использованием прошлом ваш пипетка. Затем подтвердите, что родообразные кардиомиоциты отделились, изучая блюдо, под легким микроскопом. Поместите блюдо обратно на тепловую плиту при температуре 37 градусов по Цельсию и агитировать, встряхивая.
Добавляя 10 миллимоляров и 100 миллимоляров растворов хлорида кальция, медленно увеличивать концентрацию кальция в подвеске ткани с пяти микромоляров до 1,5 миллимолара. Когда увеличение кальция завершено, используйте типсы, чтобы удалить все оставшиеся непереваренные куски ткани. Во-первых, остановить агитацию подвески.
Затем, используя 1000 микролитровую пипетку, медленно удалите 1/3 раствора из верхней части подвески. Избегайте аспирации кардиомиоцитов. Затем добавьте 700 микролитров раствора три, в клетки.
После 10 минут агитации повторите эти шаги мытья. Перенесите подвеску в 15-миллилитровую центрифугу. И позволит кардиомиоцитов осадков при комнатной температуре, в течение как минимум 10 минут и максимум 30 минут.
Удалите супернатант полностью. И повторное разрешение гранулы в модифицированном растворе тирода или желаемом буфере экспериментов. Используя световой микроскоп, проявите качество клеток.
От 30 до 50% кардиомиоцитов должны быть стержнем формы, гладкой без мембранных blebs. И дисплей, четкие перекрестные полосы. Для проверки эффективности изоляции протокол был применен к крысиной миокарду.
И по сравнению с изоляцией через коронарную перфузию и изоляцию, от небольших кусков ткани. При использовании протокола наблюдалась более низкая доля клеток в форме стержня, затем после изоляции перфузией. Но общее число по-прежнему высока.
В отличие от этого, изоляция от тканей куски, дали меньше стержнеобразных клеток. Цитометрия потока, была использована для сравнения результатов количественно. Изоляция кардиомиоцитов от ломтиков тканей, не достигает доходности, полученной коронарной перфузией.
Но обеспечивает, значительно более высокие урожаи, чем изоляция миоцитов, от тканей куски. Затем протокол был применен к миокарду человека. Изоляция от ломтиков миокарда, дали Хайд номера и большая доля стержня формы человека миоцитов.
И лишь небольшая часть округлых кардиомиоцитов. Изоляция от ломтиков миокарда, привела к поразительно большему количеству миоцитов в форме стержня, чем изоляция от кусков тканей. Фотометрическая квантификация подтвердила значительно более высокую жизнеспособность миоцитов после изоляции от ломтиков миокарда.
Клетки человека, изолированные с описанным протоколом, могут подвергаться структурному анализу. Альфа актинин окрашивания, показали плотный регулярный шаблон линии и средняя длина саркомера 1,92 микрометра, в отдыха кардиомиоцитов. LTCC и RyR окрашивания, показали четкое скопление совместно локализованных вблизи клеточной мембраны и Т трубочек.
Изолированные кардиомиоциты возбудимы и могут быть использованы для исследований клеточной электрофизиологии или возбуждения сокращения связи. Потенциальное действие формы и продолжительности, был в диапазоне сообщили другие, для желудочковых кардиомиоцитов, от отказа человеческого сердца. Переходные кальция, записанные сканированием вокальной линии Хана, показали четкий подъем после стимуляции.
И, приемлемый сигнал к соотношению шума. Кардиомиоцитов сокращения на сокращение можно увидеть от отклонения нижней границы клеток. Из-за большого количества изоляторов кардиомиоцитов, полученных по этому протоколу, возможна клеточная культура.
Это может позволить для передачи генов, фармакологического тестирования и тканевой инженерии человека кардиомиоцитов. Важным приложением является проверка результатов, полученных с животных моделей в клетках человека. Сердечная недостаточность является клиническим синдромом с очень ограниченными терапевтическими возможностями.
Улучшенные методы изоляции кардиомиоцитов помогут определить клеточные цели для диагностики и будущих методов лечения.
