פרוטוקול זה עובד עם דגימות מלבבות של בני אדם ובעלי חיים, גם לאחר שעות של זמן תחבורה. ניתן לבודד עד 200 מיוציטים למיליגרם מפרוסות רקמה חתוכה ברטט. ניתוח אלקטרופיזיולוגי, מבני וביוכימי של קרדיומיוציטים, מסייע לגלות ולהבין טוב יותר, מנגנונים של מחלות לב.
לאחר מילוי צלחת תרבות רקמה 100 מילימטר, עם 20 מיליליטר של פתרון חיתוך קר, מניחים את דגימת הרקמה בצלחת התרבות. שומרים את צלחת התרבות על צלחת מקורר ל 4 מעלות צלזיוס. זכור כי דגימות רקמה חיה מבעלי חיים ובמיוחד בני אדם הם זיהומיות פוטנציאליות.
השתמש מספריים או אזמל, כדי להסיר רקמה fibrotic עודף שומן אפיקארדיאל, מן המדגם. לעיבוד רטט אופטימלי של דגימות רקמה גדולות יותר, השתמש באזמל כדי לחתוך שמונה קוביות מילימטר מן הרקמה. עבור דגימות קטנות יותר של ביופסיות, זה לא הכרחי.
אפשר לזהות את האפיקארדיום לפי שכבת השומן האפיקארדיאלית. לאחר הסרת שומן עודף, מניחים את בלוק הרקמה, לתוך המנה, עם epicardium פונה כלפי מטה. כדי להתכונן להטמיע רקמות, להרתיח 400 מיליגרם של נקודת התכה נמוכה התעוררה בעשרה מיליליטר של פתרון חיתוך.
מלאו מזרק של 10 מיליליטר בג'ל אגרוז מומס חם. לאטום את המזרק ולה מניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את agarose כדי לצייד. באמצעות ממטרות, להעביר את הדגימה לקצץ לתוך צלחת תרבות רקמה 35 מילימטר נקי, עם epicardium פונה כלפי מטה.
לאחר מכן, להסיר נוזל עודף מן הדגימה, עם ספוגית סטרילית. אבטח את הדגימה מפני תנועה, על ידי החזקתה בממטרים. ולרוקן את המזרק של agarose מעליו, הקפד לטבול לחלוטין את הדגימה.
מיד הניחו את המנה על הקרח ותנו לאגארוז להתגבש במשך 10 דקות. הר סכין גילוח לא שימוש למחזיק הלהב של הרטט. במידת האפשר, כייל את הרטט, על ידי כוונון הסטת Z של הלהב.
השתמש אזמל כדי excise בלוק רקמת אגרוז שמתאים למחזיק הדגימה של הרטט. כדי להבטיח יציבות, ודא הרקמה עדיין שקוע מספיק אגרוז. עם שולי אגרוז, של לפחות שמונה מילימטרים.
יש למרוח שכבה דקה של דבק ציאנואקרילאט על מחזיק הדגימה. ובעדינות ללחוץ על בלוק רקמת agarose, על המחזיק. לבנות אמבטיה רטט, עם פתרון חיתוך.
לאחר מכן, מלאו את מיכל הקירור החיצוני של הרטט בקרח כתוש, כדי לשמור על טמפרטורה של ארבע עד שש מעלות צלזיוס, לאורך כל תהליך החיתוך. מניחים את מחזיק הדגימה, המכיל את בלוק רקמת אגרוז, לתוך אמבטיית הרטט. באמצעות הגדרות הרטט המתוארות בכתב היד, יש ליצור פרוסות בעובי 300 מיקרוליטר.
זה חיוני כדי ליצור קטעים אפיקרדיום מקביל כי זה איך סיבי cardiomyocyte מיושרים בקיר החדר. אחרת, יהיה יותר מדי נזק. השתמש במיקרוסקופ אור סטנדרטי, כדי לבדוק את היישור של הקרדיומיוציטים ופרוסות הרקמה.
כדי למנוע פגיעה ברקמה, החזק את ההתעוררות, במקום את הרקמה עצמה. סיבי קרדיומיוציטים, צריך להיות מיושר באופן אחיד ואת myocytes, לא צריך להיות מתכווץ. מניחים צלחת חום על שייקר המעבדה ומחממים אותה ל-37 מעלות צלזיוס.
התחל את שייקר המעבדה ב 65 סל"ד. ממיסים את החלבון בשני מיליליטר של פתרון אחד. ולהמיס את הקולגנס, בשני מיליליטר של פתרון אחד.
אבל לא מערבבים את החלבון ואת הקולגנאז. מוסיפים סידן כלורי לתספורת הקולגנס, לריכוז סופי, של חמישה מיקרומולרים. דגירה שני הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס.
השתמש מדפים כדי להעביר פרוסת רקמה לצלחת תירתית רקמה 60 מילימטר נקי. עם חמישה מילימטרים של פתרון חיתוך מצונן מראש. שמירה על המנה על קרח או צלחת קרה, להסיר בזהירות את agarose מן הרקמה, באמצעות להב או מדפים.
כדי לבצע את הכביסה הראשונית של פרוסות הרקמה, מניחים צלחת תרבות רקמה נקייה של 35 מ"מ על להב החום. ולמלא אותו, עם שני מילימטרים של פתרון מחומם מראש אחד. מעבירים פרוסת רקמה אחת או שתיים לצלחת המוכנה.
לאחר מכן השתמש פיפסה מילימטר אחד, עבור צעדי הכביסה. לאחר שטיפת הפרוסות, מוציאים את הפתרון מהצלחת ומוסיפים שני מיליליטר של תוסף החלבון. הדגירה את הפרוסות במשך 12 דקות על להב החום, עם שייקר ב 65 סל"ד.
לשטוף את פרוסות הרקמה פעמיים נוספות, עם שני מיליליטר של פתרון מחומם מראש אחד. לאחר מכן, להסיר פתרון אחד מן המנה ולהוסיף שני מיליליטר של פתרון קולגן. הדגירה את הפרוסות לפחות 30 דקות על להב החום, עם רעידות ב 65 סל"ד.
לאחר 15 דקות של דגירה, לבדוק מיוציטים בודדים חינם, על ידי בחינת המנה תחת מיקרוסקופ אור. המשך לבדוק כל חמש דקות, עד מיוציטים בודדים גלויים. לאחר מכן, עיכול alt על ידי שטיפת הפרוסות פעמיים, עם שני מיליליטר של פתרון מחומם מראש שתיים.
ול מילוי המנה, עם שני מיליליטר של פתרון 2. בזהירות למשוך את הסיבים של פרוסת הרקמה לגזרים, באמצעות מדפים עדין. המשך לעבוד בזהירות, כדי למנוע פגיעה בקרדיומיוציטים.
ופיגט מספר פעמים, עם שימוש אחד בעבר פיפטה שלך. לאחר מכן, ודא כי cardiomyocytes בצורת מוט נפרדו, על ידי בחינת המנה, תחת מיקרוסקופ אור. מניחים את המנה בחזרה על צלחת החום ב 37 מעלות צלזיוס ומתסיסים על ידי טלטול.
על ידי הוספת 10 מילימולאר ו 100 מילימולר סידן כלוריד פתרונות מלאי, לאט להגדיל את ריכוז הסידן של ההשעיה רקמה מחמישה micromolar ל 1.5 מילימולאר. כאשר עליית הסידן הושלמה, השתמש במטסים כדי להסיר את כל גושי הרקמות שנותרו מעוכלים. ראשית, לעצור את התסיסה של ההשעיה.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה 1000 microliter, לאט להסיר 1/3 של הפתרון, מהחלק העליון של ההשעיה. הימנע השאיפה של cardiomyocytes. לאחר מכן להוסיף 700 microliters של פתרון שלוש, לתאים.
לאחר 10 דקות של תסיסה, חזור על שלבי שטיפה אלה. העבר את ההשעיה לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. ולאפשר לקרדיומיוציטים להצטייד בטמפרטורת החדר, למשך 10 דקות לכל היותר ול-30 דקות לכל היותר.
הסר את העל-טבעי לחלוטין. ולתלות מחדש את גלולת בתספוס טירודה שונה או את מאגר הניסוי הרצוי. באמצעות מיקרוסקופ אור, לאמת את איכות התא.
30 עד 50% מהקרדיומיוציטים צריכים להיות בצורת מוט, חלקים ללא פעימות קרום. ולהציג, צלב ברור. כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול הוחל על שריר הלב של העכברוש.
ובהשוואה לבידוד באמצעות תדלוק כלילי ובידוד, מגודרי רקמות קטנות. שיעור נמוך יותר של תאים בצורת מוט נצפתה בעת שימוש בפרוטוקול, ולאחר מכן לאחר בידוד על ידי חיסון. אבל המספר הכולל עדיין היה גבוה.
לעומת זאת, בידוד מגושי רקמות, הניב פחות תאים בצורת מוט. ציטומטריית זרימה, שימשה להשוואת התוצאות באופן כמותי. הבידוד של קרדיומיוציטים מפרוסות רקמות, אינו מגיע לתשואה המתקבלת על ידי חיסון כליילי.
אבל מספק, תשואות גבוהות משמעותית מאשר בידוד myocyte, מגושים רקמה. לאחר מכן, הפרוטוקול הוחל על שריר הלב האנושי. בידוד מפרוסות שריר הלב, מספרי הייד שהניבו ושיעור גדול של מיוציטים אנושיים בצורת מוט.
ורק חלק קטן מהקרדיומיוציטים מעוגלים. בידוד מפרוסות שריר הלב, הביא למספר גבוה יותר באופן בולט של מיוציטים בצורת מוט, מאשר בידוד מגזי רקמות. כימות פוטומטרי אישר כדאיות מיוציט גבוהה משמעותית לאחר בידוד מפרוסות שריר הלב.
תאים אנושיים, מבודדים עם הפרוטוקול המתואר, יכולים להיות נתונים לניתוח מבני. כתם אלפא אקטין, חשף דפוס קו Z רגיל צפוף ואורך סרקומר ממוצע של 1.92 מיקרומטר, בקרדיומיוציטים במנוחה. כתם LTCC ו- RyR, הראה אשכול ברור הוא מקומי במשותף ליד קרום התא ו T tubules.
הקרדיומיוציטים המבודדים היו נרגשים ונוכלים לשמש למחקרים על אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות ציריות. צורה ומשך פעולה פוטנציאליים, היה בטווח שדווח על ידי אחרים, עבור קרדיומיוציטים חדרית, מלבבות אנושיים כושלים. הסידן חולף שהוקלט על ידי סריקת קו קולי חאן, הראה עלייה ברורה לאחר גירוי.
וגם, אות מקובל ליחס רעש. קיצור Cardiomyocyte על ידי התכווצות ניתן לראות מן הסטה של גבול התא התחתון. בשל המספר הגבוה של מבודדים קרדיומיוציטים שהושגו על ידי פרוטוקול זה, תרבות התא אפשרית.
זה עשוי לאפשר העברת גנים, בדיקות פרמקולוגיות והנדסת רקמות של קרדיומיוציטים אנושיים. יישום חשוב, הוא אימות ממצאים, ממודלים של בעלי חיים בתאים אנושיים. אי ספיקת לב היא תסמונת קלינית עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות מאוד.
טכניקות בידוד קרדיומיוציט משופרות יסייעו בזיהוי מטרות תאיות לאבחון וטיפולים עתידיים.
