Usando este protocolo, las rodajas de tejido ventricular izquierdo humano se pueden cultivar ex vivo en una cámara biomimética. La aplicación de pre y postcargas mejora la semejanza del entorno fisiológico. Esta técnica permite el registro continuo de la contracción del tejido.
Los protocolos de estimulación definidos por el usuario permiten la evaluación de parámetros vitales de contracción como la potenciación posterior a la pausa, el umbral de estimulación, la relación fuerza-frecuencia y el período refractario. El cultivo a largo plazo de rebanadas de miocardio, utilizando esta configuración, allanará el camino para futuras investigaciones ex vivo, facilitando esta detección de efectos farmacológicos terapéuticos y cardiotóxicos en medicina cardiovascular. Para comenzar, sumerja las cámaras de cultivo y los electrodos de grafito en un litro de una solución de isopropanol al 10% y agite durante la noche.
Al día siguiente, transfiera las cámaras a una solución de isopropanol al 100% durante 3 minutos, luego permita que las cámaras y los electrodos de grafito se sequen al aire bajo una campana de flujo laminar. Conecte una placa de circuito a cada cámara de acuerdo con las posiciones disponibles en el balancín. Coloque dos electrodos de grafito en la placa de circuito según las instrucciones del fabricante, luego coloque una tapa de placa de Petri de 35 milímetros en la cámara para evitar infecciones.
A continuación, llene la bandeja de corte hasta un 90 a 95% con tampón de corte. Transfiera la muestra de tejido a una placa de Petri de 100 milímetros llena de tampón de corte frío y coloque la placa en una placa de enfriamiento a 4 grados centígrados. Retire las trabéculas endocárdicas sosteniendo el endocardio con pinzas, luego use tijeras para cortar aproximadamente 3 milímetros de tejido endocárdico.
Fije la muestra de tejido cortado, lado endocárdico hasta un parche de goma de 2 por 2 centímetros utilizando cuatro agujas de calibre 20 de 0,9 por 70 milímetros que se fijan en una posición cuadrada. Asegúrese de que el borde diagonal de cada punta de la aguja apunte hacia adentro, mejorando la fijación y previniendo daños en el miocardio. Con un bisturí, corte todo el exceso de tejido fuera de los cuatro cuadrados de la aguja.
Con pinzas, coloque la muestra recortada en un trozo de tejido estéril durante 10 segundos para eliminar el exceso de tampón de corte. A continuación, retire la jeringa de agarosa del baño de agua y sumerja la muestra en agarosa. Deje que la agarosa se solidifique durante cinco minutos en una placa de enfriamiento.
El lado endocárdico de la muestra debe ser visible en la agarosa. Usando pinzas, coloque el lado epicárdico de la muestra contenida en la agarosa en la parte superior del área pegada, luego presione suavemente la muestra que contiene agarosa desde la parte superior con una herramienta roma sin cortar o dañar la agarosa. Deje que el pegamento se solidifique durante 1 minuto.
Ajuste la amplitud de vibración a 1 milímetro, la velocidad de corte inicial a 0,07 milímetros por segundo y el grosor de la rebanada a 300 micras. Después de conectar el sistema de cultivo a una computadora, inicie el programa de software correspondiente. Ajuste la velocidad del balancín a 60 rpm y preestablezca los parámetros de estimulación.
Para las rebanadas cardíacas humanas, establezca la estimulación estándar a impulsos bifásicos con 50 miliamperios o corriente que consiste en 3 milisegundos de corriente positiva, 1 milisegundo de pausa y un pulso de 3 milisegundos de corriente invertida a una velocidad de ritmo de 30 latidos por minuto o lpm, luego verifique los indicadores de electrodos del software y verifique que los electrodos de las cámaras de cultivo funcionen correctamente. Usando pinzas, separe la agarosa del tejido. Evite tocar el tejido y manipularlo con cuidado, ya que cualquier daño al tejido reducirá la tasa de éxito del cultivo.
Para unir dos triángulos de plástico a una muestra, coloque 1 microlitro de pegamento en una tapa estéril de placa de Petri. Use una pinza enganchada para recoger un triángulo de plástico en autoclave. Sumerja rápidamente el borde frontal del triángulo en el pegamento y pegue el triángulo sobre la muestra perpendicular a la alineación de los cardiomiocitos.
Repita para el otro triángulo. Con un bisturí, recorte el tejido que exceda el ancho del triángulo y coloque la rebanada con los dos triángulos montados de nuevo en la bandeja de corte que contiene el tampón de corte. Retire la cámara de cultivo de llenado medio de la incubadora.
Seleccione una rebanada preparada e insértela en la cámara conectando un triángulo a cada pasador. Ajuste la distancia entre los pines de montaje al tamaño de la muestra. Asegúrese de que la muestra esté sumergida en el medio.
Después de colocar el plato en el balancín, disminuya la precarga girando el tornillo de ajuste en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que la línea de base del gráfico correspondiente en la pantalla de la computadora ya no cambie, luego aumente cuidadosamente la precarga o la tensión girando el tornillo de ajuste en el sentido de las agujas del reloj. Para cámaras con alta rigidez, continúe hasta que la línea de base correspondiente en el gráfico haya aumentado de 1,000 a 1, 200 unidades correspondientes a una precarga de mililinewton. Después de preparar el medio de cultivo fresco, caliente previamente el medio en un baño de agua o incubadora de aire caliente a 37 grados Celsius durante 30 a 45 minutos.
Retire el medio de la cámara, dejando aproximadamente 0.8 mililitros en la cámara, luego agregue 1.6 mililitros de medio fresco a la misma cámara, haciendo un volumen total de medio a 2.4 mililitros por cámara. Finalmente, coloque la cubierta de la cámara hacia atrás y coloque la cámara de cultivo en su posición respectiva. La lectura de la contracción de cinco rebanadas de miocardio durante una estimulación típica consistió en cuatro secciones distintas de potenciación posterior a la pausa, umbral de estimulación, relación fuerza-frecuencia y período refractario.
En comparación con el control, la fuerza de contracción de las rebanadas tratadas con antagonistas del calcio, nifedipino y calciseptina, disminuyó en 10 minutos. En contraste, el agonista del canal de calcio dependiente de voltaje, Bay-K8644, aumentó la fuerza de contracción. Se evaluó la potenciación post-pausa de las lonchas control y tratadas para la liberación intracelular de calcio del retículo sarcoplásmico.
El segmento de control no mostró ningún cambio. En presencia de calciseptina y nifedipino, la inhibición de los canales de calcio tipo L condujo a la potenciación de la primera contracción después de una pausa de 50 segundos, lo que refleja una mayor contribución relativa de la liberación de calcio intracelular a la contractilidad total. El efecto contrario se observó con Bay-K8644, que estimula la entrada de calcio extracelular a través de los canales de calcio de tipo L.
En el análisis de la relación fuerza-frecuencia, no se observó ningún cambio en el segmento de control. El tratamiento con calciseptina no cambió la capacidad de la rebanada para seguir los estímulos tras un aumento de la frecuencia de estimulación al comparar los datos previos y posteriores al tratamiento. En comparación con la calciseptina, la nifedipina previno un aumento de la contractilidad a tasas de estimulación más altas y redujo la tasa máxima de captura a 80 lpm.
Con Bay-K8644, se observó un aumento de la fuerza de contracción a frecuencias de estimulación muy bajas. Sin embargo, a frecuencias superiores a 50 lpm, la fuerza de contracción fue menor que durante la condición previa al tratamiento. El tejido extirpado debe transferirse rápidamente a cardioplejia de 4 grados.
Después del corte, los triángulos de plástico deben unirse perpendicularmente a la dirección de la fibra. La precarga no debe exceder los 1500 milinewton. El cultivo biomimético de rebanadas puede ayudar a los investigadores a utilizar manipulaciones genéticas, así como terapias basadas en células para estudiar la regeneración y la reparación en el miocardio humano adulto.
