Este protocolo nos permite realizar una manipulación genética in vivo en un modelo animal clave que nos permite estudiar la expansión y plegado de un neocórtex en desarrollo. La principal ventaja de este método es el uso de alta especificidad espacial y temporal en la orientación de las células madre neurales que son el tipo de célula clave para el desarrollo cerebral. Antes de comenzar el procedimiento, tire de los capilares de vidrio en un tirador de micro pipetas y utilice fórceps para cortar la parte distal del capilar para ajustar el diámetro de la punta capilar.
En el día embrionario 33, agregue la concentración adecuada de ADN en PBS, complementada con 0.1%Fast Green con mezcla suave, y coloque un hurón hembra embarazada, anestesiado, de 3 horas de ayuno en una mesa de operación con una almohadilla térmica. Confirme el nivel adecuado de sedación tocando la piel periocular y pellizcando la piel entre el segundo y el tercero o el tercer y el cuarto dedo de ambas extremidades posteriores. El isoflurano puede causar efectos adversos, como náuseas y mareos.
Cuando manipule isoflurano en forma líquida, utilice el equipo de protección. Durante la cirugía, utilice recipientes apropiados para capturar el gas. Inyectar al animal por vía subcutánea con analgésico, antibiótico y glucosa, y colocar ung ón en los ojos del animal.
Use pinzas para afeitar el abdomen y limpie la piel expuesta con agua, jabón y solución de yodo. Luego, seque la piel con hisopos de gasa y desinfecte con alcohol y exfoliantes de yodo. Para la electroporación del útero, coloque una cortina estéril sobre el animal y use un bisturí para hacer una incisión cutánea de aproximadamente 5 centímetros en la linea alba.
Use tijeras para cortar la capa muscular y coloque hisopos de gasa alrededor del sitio de la incisión. Humedezca la gasa con PBS y coloque el útero sobre los hisopos. Con una pipeta con una punta larga, cargue uno de los capilares de vidrio tirado con 5 microlitros de solución de ADN por embrión que se va a inyectar.
Fije el capilar cargado a un soporte y conecte el otro lado del soporte a un tubo y una boquilla. Localice la cabeza del primer embrión y coloque una fuente de luz de fibra óptica junto a la cabeza. Usando el iris pigmentado como punto de referencia, penetra la piel, el cráneo y el tejido cerebral con la punta del capilar de vidrio y usa el pipeteo bucal para facilitar la entrega de 3-5 microlitros de la solución inyectable en el ventrículo de uno de los hemisferios cerebrales.
Debido a que la solución inyectada contiene 0.1%Fast Green, una inyección exitosa resultará en una tinción de color verde oscuro del ventrículo inyectado, que ahora será visible como una estructura en forma de riñón. Después de la inyección, coloque los electrodos de pinza en el útero por encima de la cabeza del embrión con el polo positivo por encima del área a apuntar y el polo negativo por debajo del área inyectada. Establezca la longitud del pulso del electroporato en 50 milisegundos, el voltaje del pulso a 100 voltios, el intervalo de pulso en un segundo y el número de pulsos a cinco.
Cuando se hayan ajustado todos los parámetros, presione Pulse"y suelte rápidamente varias gotas de PBS caliente en el embrión electroporado. Cuando todos los embriones han sido electroporados, devuelve el útero a la cavidad peritoneal y usa una sutura 4-0 para cerrar la capa muscular con el peritoneo. Cierre la piel de una manera similar y cubra la herida con spray de aluminio.
A continuación, devuelva al animal a su jaula con una fuente de calor y monitoreo hasta la plena reclinencia. Cuatro días después de la electroporación en el día embrionario 37, la mayoría de las células objetivo y su progenie todavía están en las zonas germinales y las células rara vez se observan más basalmente dentro de la placa cortical. La identidad del progenitor puede ser examinada por inmunofluoresencia para marcadores de células ciclistas, como PCNA, mientras que un subconjunto de progenitores sometidos a mitosis puede mostrarse mediante marcadores como la fosfo-histona 3.
En el día postnatal cero, ocho días después de la electroporación, la progenie de las células objetivo se extendió a todas las capas histológicas. Usando una combinación de marcadores de factor de transcripción, se pueden revelar diferentes poblaciones basales de progenitores. Por ejemplo, Sox2 es un marcador de células progenitoras proliferativas, incluida la glia radial basal.
Y la proteína cerebral T-box 2 es un marcador de progenitores basales neurogénicos, que son principalmente progenitores intermedios. Para el día 16 postnatal, la mayoría de las células objetivo dejan de dividirse y se diferencian en neuronas y glia, con hurón postnatal día 16 neocórtex que exhibe el patrón de plegado característico. La electroporación en el útero de embriones de hurón es un método extremadamente potente para estudiar la función de los genes.
Nos ha permitido estudiar genes que han estado implicados en la expansión del neocórtex en la evolución, incluyendo genes específicos del ser humano. Y usando este poderoso método, de hecho hemos sido capaces de averiguar características clave de cómo la expansión evolutiva del neocórtex humano probablemente funcionó.
