Los autores desean agradecer el apoyo del Instituto del Cáncer Cancer Research Award Samuel Oschin Integral Foro, así como los fondos del Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, y la familia de Guerin. El proyecto que se describe fue apoyado en la forma de un CTSI Core Vale financiado por el Centro Nacional de Recursos para investigación, Grant UL1RR033176, y ahora está en el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, de Grant UL1TR000124. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

Este procedimiento es conforme a los requisitos Cedars-Sinai IACUC. Los investigadores deben velar por el cumplimiento IACUC institucional antes de proceder. Todas las herramientas y los reactivos deben ser esterilizados antes de su uso. 1. Preparación de herramientas, soluciones, y la mezcla de ADN <ol><li> Inserte borosilicato pulido tubos capilares de vidrio de 100 mm de incendio en un extractor de micropipeta. Ajuste de calefacción para permitir la extracción ponderada estándar para formar la punta de la pipeta de aproximadamente 17,5 mm. Cortar las extremidades con tijeras quirúrgicas nítidas a una distancia aproximadamente de 8-9 mm desde el principio de la punta para crear más o menos una abertura de 100 micras de diámetro. </li><li> Hacer una reserva 1% w / v solución verde rápido mezclando agua libre de nucleasa filtrada (utilizando un filtro de jeringa de 20 micras) con el verde de secado rápido. </li><li> Aislar ADN purificado libre de endotoxina plásmido que está altamente concentrada (es decir,&gt; 3 g / l), diluido en Tris-EDTA (TE) tampón. Añadir cantidades deseadas de plásmidoa la mezcla diluida en tampón TE y añadir una proporción de 1:10 de la solución de verde rápido 1% (o sea un 0,1% w / v de concentración final de verde rápido). Utilice una concentración final 0,5-2,0 g / l de plásmido para la expresión robusta de transgenes. </li></ol> 2. Anestesia para animales, Pipeta Loading, y Pial Superficie plásmido Inyección <ol><li> Inducir la anestesia hipotermia en 1-2 días los ratones postnatales que los coloca en una placa de Petri que se coloca en hielo durante 5-8 minutos (dependiendo de la edad de las crías / peso del tiempo). Una vez que la hipotermia se confirma por la falta de movimiento de dedo del pie-pellizcos y / o la cola reflejo, los ratones son lista para ser inyectada. Coloca los animales de vuelta en el hielo si los reflejos de dolor son evidentes. El procedimiento de inyección y electroporación tardan menos de 2-3 minutos en total, así que tiempo de la hipotermia, la inyección, y los procedimientos de electroporación en consecuencia para mantener la anestesia adecuada. </li><li> Durante la anestesia, usando una pipeta estándar, cuidadosamente pipeta cantidad de plasmi desead mezclar a inyectar (0,5-2 l) en un pedazo de película de cera de parafina para referencia. Aquí, se inyecta un volumen total de 0,5 l de la mezcla de plásmido. A continuación, utilizando un inyector de micro, inserte cuidadosamente ensambladas pipeta capilar de vidrio en el tubo que contiene mezcla de plásmidos. Tome precauciones adicionales para evitar que la punta se rompa por asegurarse de que no toque los bordes del tubo. Aspirar la solución en la pipeta marcando lentamente el dial de transferencia. Una vez que un volumen suficiente ha sido cargado en la pipeta, marque hacia adelante hasta que la presión vuelve a la posición neutra de 0 hPa. </li><li> El uso de 300-450 hPa de presión para la inyección para asegurar la presión adecuada para el llenado uniforme de la superficie / espacio meníngeo pial, coloque la punta cerca de la inyección de parafina referencia cinematográfica cera pipeta (desde 2.2) y utilizar el pedal del inyector micro para expulsar un volumen sobre la película de cera de parafina. Ajuste la presión en consecuencia hasta que la cantidad expulsada es igual a la referenc previamente pipeteadael volumen de correo. </li><li> Una vez que la punta ha sido equilibrada y la anestesia se ha confirmado, cachorros están listos para ser inyectado. </li><li> El objetivo del experimento es para inyectar la mezcla de plásmido bajo el cráneo y por encima de la superficie de la pía madre para permitir para la electroporación de ADN hacia abajo en los progenitores superficie pial (Figura 1A). Para las inyecciones de la corteza, mantenga el cachorro hacia abajo con el pulgar y el dedo índice de la mano menos dominante. Los hemisferios corticales y otras estructuras superficiales tales como los tubérculos cuadrigéminos superiores son visibles entre P0 y P2, lo que permite la fácil orientación de estas estructuras (Figura 1B). Uso de la región dominante mano y de destino deseado de la corteza (es decir, motor, somatosensorial, etc), insertar la pipeta más allá de la piel y el cráneo con cuidado para evitar las arterias cerebrales. Asegúrese de que para evitar cualquier penetración adicional de la punta más allá del cráneo (que se indica por la falta de resistencia adicional justo después de la perforación del cráneo). </li><li> Inyectar plasmaID de solución mediante el pedal del inyector micro y asegúrese de que se dispersa de forma homogénea en el tejido (Figura 2A). Nota: Es muy importante determinar empíricamente un enfoque que maximiza la entrega plásmido evitando al mismo tiempo un hematoma debido a la presión de fluido. Esto se puede hacer mediante el ajuste de la duración de la inyección, el ángulo, el volumen, y el sitio diana precisa para evitar la interrupción vascular. </li><li> No deje de probar y mantener la punta de la desecación entre inyecciones colocando la punta en forma de gotitas de prueba de las inyecciones de operaciones anteriores en el papel de la cera de parafina o película plástica. Esto es necesario para evitar la acumulación de punta de solución de ADN se evaporó y se cristalizó, que puede resultar en la obstrucción de la punta y volúmenes de entrega inconsistentes. </li></ol> 3. Electroporación <ol><li> Ajuste el Electroporador a 135-150 V para cinco pulsos, con una duración de 50 ms, con 950 ms en intervalos entre cada pulso. Con el fin de aumentar la conductancia yevitar la quema de la piel, cubrir de 3 mm tweezertrodes platino con gel de electroporación. Compruebe si los reflejos de los pies-pellizcos y de la cola en este punto para asegurar la anestesia. Si sensible, colocar en hielo durante varios minutos para anestesiar. </li><li> Para la corteza (y colículo superior) inyecciones, emplear un electrodo de 3 mm (Figura 2B) para aumentar la viabilidad de las crías (en comparación con el 7 - y 10-mm electrodos, que se utilizan para la electroporación zona ventricular). Coloque la sonda cargada negativamente del electrodo sobre la zona de inyección y la sonda cargada positivamente alrededor de la región contralateral debajo del ojo de tal manera que la orientación del electrodo es en un ángulo de 45-60 ° con relación a la línea media (Figura 2C). </li><li> Use el pedal del electroporador para activar la corriente y mantenga tweezertrodes en lugar de 3-5 pulsos, dependiendo de la edad de las crías y el peso, la orientación efectiva de ADN en las células de la superficie pial subyacentes en la contabilización de curvaturade los hemisferios. Nota: El polo negativo se puede barrer sobre la zona de inyección en entre pulsos o un electrodo más grande puede ser empleado para aumentar el área de electroporación. </li><li> Inmediatamente después de la electroporación, la limpieza cuidadosa del gel a partir de crías y colocarlos bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 5 min. </li><li> Los cachorros serán agudamente perder su color rojizo y rosado natural en los minutos después de la electroporación por cianosis. Tenga en cuenta las crías para la recuperación de color natural y el inicio de un movimiento normal antes de devolverlos a sus jaulas. </li><li> Asegúrese de resocialización con la madre observando si ella trae las crías al nido y comienza la preparación de ellos. Si ella se vuelve agresivo, asegúrese de que las crías no tienen restos de gel y los incuban con algunos de la ropa de cama para transferir el olor de los cachorros. </li></ol> 4. Modificaciones para Apuntando al colículo superior Orientación: <ol><li> Inject el colículo superior de la misma manera como la corteza, pero en cuenta que la región diana se encuentra justo posterior y lateral a lambda y más o menos en la línea media (Figuras 3A y 3B). Con inyecciones exitosas, la mezcla de plásmido llena, naturalmente, los contornos de la colículo superior. Una vez que las inyecciones se han realizado con éxito, los animales están listos para la electroporación. </li></ol> Electroporación: <ol><li> De manera muy similar, para inyecciones del colículo superior, colocar la sonda cargada negativamente del electrodo sobre la zona de inyección y la sonda cargada positivamente alrededor del ojo, hocico o la barbilla, la conducción de ADN en las regiones superficiales de la colículo superior (Figura 3C) . En este caso, la orientación del electrodo es en un ángulo de 25-40 ° con relación a la línea media. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El aspecto más crítico para la electroporación éxito de progenitores superficie pial son: 1) la orientación de la mezcla de plásmido a la superficie de la pía madre; 2) evitando la generación de hematomas en el lugar de la inyección; y 3) evitar la mortalidad asociada con la electroporación mesencéfalo. Apropiadamente la orientación de la superficie de la pía madre se lleva a cabo por punción medido y cuidadoso del cráneo para evitar la penetración de la superficie de la pía...

Células madre y progenitoras neurales están presentes en todo el SNC de mamíferos 1, 2. Su naturaleza y propiedades en zonas germinales embrionarias y adultas que rodean las regiones ventriculares del cerebro y la médula espinal han sido ampliamente documentados en la década pasada 1-3. En gran parte, esto se ha debido al desarrollo de herramientas genéticas cada vez más precisas, como el sistema nervioso específico recombinación Cre de alelos floxed o linaje retroviral trazando 4. Sin embargo, una región-el progenitor pial progenitor superficie de la zona-sólo recientemente ha sido descrito en detalle 5-7 y espera examen exhaustivo. La superficie de la pía madre del cerebro se define como la interfaz entre la superficie del cerebro y las meninges que rodean 8. Durante el desarrollo, neuroepitelial y, más tarde, radiales pies terminales gliales se adhieren a esta superficie de 9,10. Algunos de los abetosst neuronas en el cerebro humano y muchas mitosis neuronales se observan en esta región 11. Más tarde, durante la neurogénesis embrionario, las interneuronas corticales son conocidos para atravesar la región de la pía madre, además de sus rutas migratorias en la zona intermedia y la zona subventricular 12-14. Durante este período, las células madre pueden ser cultivadas a partir de esta zona y que parece ser un centro activo de la neuro-y gliogenesis 5. En el cerebro adulto, se ha informado de que las interneuronas pueden nacer de progenitores superficie pial siguiente desafío hipóxico 7. Sin embargo, la contribución de esta región a su a genensis durante el desarrollo embrionario y posnatal ha permanecido en la oscuridad, en parte debido a la dificultad de investigar específicamente esta región 6. En el colículo superior y en la corteza cerebral, interneuronas superficiales (o capa I en la corteza) pueden modular la salida del circuito de poblaciones de neuronas excitatorias subyacentes y por lo tanto contribuir cantidaantly a la función de estas estructuras. En particular, la capa 1 interneuronas están en una posición privilegiada para regular la descarga de las neuronas a través de las capas superiores de la corteza cerebral, dada su amplia conectividad a las capas superficiales y profundas de las columnas corticales 15,16. En una manera similar, las interneuronas horizontales reciben excitatorios de entrada a partir de fibras corticales y retinales, proyecto sobre un área relativamente amplia y se especula para mediar en la inhibición de las poblaciones neuronales que responden a estímulos visual remota 17,18. Además, su morfología es muy adecuado para jugar un papel potencial en la actividad de las ondas con dibujos en el desarrollo del sistema visual 19. Curiosamente, el desarrollo de las interneuronas y maduración ocurre en gran medida después del nacimiento. Además, este proceso de maduración se ha encontrado para ser regulada por la actividad neuronal y por lo tanto es un sustrato de la plasticidad del desarrollo con consecuencias de por vida sobre la función del circuito 20,21. Notablemente, No Los promotores se describen que pueden dirigirse específicamente a estas células transgénica. La división de progenitores pueden ser dirigidos con retrovirus 7, pero la producción de virus es mucho tiempo y requiere habilidad para producir los altos títulos necesarios para la transducción de células. La electroporación ha llevado a un renacimiento en el estudio de desarrollo neurológico, ya que permite la interrogación genético rápido y eficiente de las vías de señalización de los progenitores neurales 4, 22, 23. La electroporación implica la inyección de ADN plásmido, seguido de la entrega de pulsos eléctricos a la parte exterior de la cabeza, para conducir unidireccionalmente el ADN en los progenitores proliferantes que rodean los ventrículos 4, 22, 23. La electroporación parece requerir el tránsito de células a través de la fase M del ciclo celular para la expresión de los transgenes plásmido 24. Específicamente, se ha encontrado que sólocélulas que pasan a través de la fase M dentro de 8 horas de la electroporación de plásmidos expresarán transgenes a pesar de su entrega efectiva a todas las células dentro de ~ 160 m de la pared ventricular 24. Se especula que esto se debe a la necesidad de la envoltura nuclear desglose en que permite un acceso nucleares de los plásmidos episomales, como los productos químicos que causan la permeabilización nuclear puede inducir la expresión de los plásmidos en las células mitóticas poste 25. Originalmente empleado en el embrión 22, electroporación se adaptó para su uso en el cerebro postnatal mucho más tarde 26, 27. Recientemente, hemos adaptado la electroporación para su uso en la manipulación genética de los progenitores superficie pial 6. Además, usando este enfoque, hemos demostrado que hay aparentemente dos linajes distintos de los progenitores en esta región-interneuronal y astrocítico 6. Este protocolo detalla una manera simple, rápida y potente para atacar estas células durante el interrogatorioel desarrollo de mecanismos de regulación de estas células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

En los últimos años la superficie pial ha sido identificado como un nicho germinal de importancia durante embrionario, perinatal y adultos neuro-y gliogénesis, incluyendo después de la lesión. Sin embargo, los métodos para interrogar genéticamente estas poblaciones progenitoras y el seguimiento de sus linajes habían sido limitadas debido a la falta de especificidad o mucho tiempo la producción de virus. Por lo tanto, el progreso en esta región ha sido relativamente lento con sólo un puñado de investigaciones de esta ubicación. La electroporación se ha utilizado durante más de una década para estudiar las propiedades de células madre neurales en el embrión, y más recientemente en el cerebro postnatal. Aquí se describe una técnica eficiente, rápido, y sencillo para la manipulación genética de los progenitores superficie pial basadas en un enfoque adaptado electroporación. Pial electroporación superficie permite el etiquetado genética fácil y manipulación de estos progenitores, lo que representa un enfoque de ahorro de tiempo y económico para el estudio de estas células.

Pial superficie resultados de electroporación en la expresión de ADN plásmido en las células progenitores-sobre todo-en o cerca de la superficie pial 6. Más específicamente, la orientación de los electrodos es crítica en el dictado de la dirección del movimiento plásmido y expresión posterior. Por lo tanto, en configuraciones de electrodos duales, el plásmido está dirigida más o menos en un vector recta entre el electrodo negativo y positivo. Por lo tanto, si el polo negativo se coloca sobre el ...

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Neonatal Pial Surface Electroporation

La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las células hijas.

Neonatal electroporación superficie pial

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K vistas.  Cedars-Sinai Medical Center.  La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el d...

Video: Neonatal Pial Surface Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

La electroporación neonatal zona subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying neonatal seizures and hypoxia ischemia. This manuscript describes a method for continuous video electroencephalogram (EEG) monitoring in neonatal mice to detect seizures and analyze EEG background during hypoxia ischemia. Use of video and EEG in conjunction allows description of seizure semiology and confirmation of seizures. This method also allows analysis of power spectrograms and EEG background pattern trends over the experimental time period. In this hypoxia ischemia model, the method allows EEG recording prior to injury to obtain a normative baseline and during injury and recovery. Total monitoring time is limited by the inability to separate pups from the mother for longer than four hours. Although, we have used a model of hypoxic-ischemic seizures in this manuscript, this method for neonatal video EEG monitoring could be applied to diverse disease and seizure models in rodents.

This manuscript describes a method for continuous video EEG recordings using multiple depth electrodes in neonatal mice undergoing hypoxia-ischemia.

Electroencefalograma de video continuo durante la hipoxia-isquemia en ratones neonatales

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

Micro-TC y procesamiento de imágenes del cerebro neonatal del ratón

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Autor destacado: Imágenes de alta resolución de cerebros neonatos de ratón: un protocolo de micro-TC con el agente de contraste en solución de Lugol

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Imágenes de micro-TC y análisis morfométrico de cerebros neonatales de ratones

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...