Este trabajo fue apoyado por el Centro de terapias regenerativas, la Facultad de Medicina de la TU Dresden y la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 subproyecto). BA fue apoyado por una beca del programa DIGS-BB, de Dresde. Agradecemos a los Dres. Noriko Osumi, Nomura Tadashi, Lie Dieter Chichung y Ravi Jagasia de valiosos consejos durante la creación de la electroporación in utero y la inyección estereotáxica viral.

Nota preliminar La cirugía debe ser realizada por investigadores entrenados completamente tras la aprobación de las autoridades locales para el bienestar animal. Todas las precauciones se deben tomar para minimizar el dolor y el estrés causado al animal, incluyendo anestesia profunda, la administración de analgesia postoperatoria y, para las operaciones que duran más de 10 minutos, la aplicación de un lubricante ocular para prevenir la deshidratación corneal y ceguera. Ratones anestesiados deben mantenerse constantemente caliente a 37 ° C hasta su recuperación completa y todas las herramientas quirúrgicas y la solución debe ser estéril. Aunque el uso de una campana biológica no es estrictamente necesario, el operador debe tomar todas las precauciones necesarias para reducir al mínimo la posibilidad de infectar al animal durante la operación con el uso de una bata, mascarilla y guantes. Del mismo modo, cada paso sobre la generación y el uso de virus debe ser autorizado y debe llevarse a cabo en áreas S2 de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales.Finalmente, una descontaminación completa de todas las herramientas y las superficies que podría haber estado en contacto con los virus deben ser realizados de acuerdo con las prácticas de las instalaciones aprobadas desinfección (para el VIH, limpiando con 70% Et-OH y / o esterilización en autoclave). Parte 1: Expansión de Embryonic NSC 1. En la electroporación in utero <ol><li> Después de la clonación de los transgenes (es decir cdk4/cyclinD1) en PCMS-EGFP (Clontech) o pDSV-mRFPnls vectores 16, purificar los plásmidos usando kit EndoFree y se resuspende en PBS estéril a una concentración de 3-5 g / l. Poco antes de la cirugía, se mezclan los plásmidos con 0,05% FastGreen en PBS a una relación final de ca. 04:04:01 y se centrifuga la mezcla durante 2 minutos a 16.000 xg para eliminar todo precipitados. </li><li> Cargar la mezcla de ADN en un vaso previamente sacó borosilicato capilar. Tirando parámetros utilizando una pipeta P-97 Extractor son: extracción: 200; vel: 140; hora: 140. El calor es dada por un ensayo de la rampa y depende de la especificaciónmucho ific de capilares que se utiliza. Montar el capilar en la boquilla de la PicoPump que está cerca de la plataforma en la electroporación in utero (Figura 1A) y, bajo un microscopio estereoscópico, doblar su punta y nick en el punto de inflexión. </li><li> Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un vaso seco esterilizador de cuentas y profundamente anestesiar a un ratón embarazada en el día 12-15 de gestación utilizando un vaporizador de isoflurano. Colocar el animal en posición supina sobre una plataforma de calefacción a 37 ° C y mantener bajo administración isoflurano constante a través de un cono nasal. </li><li> Afeitar la piel del abdomen, desinfectar con tiempos de Betaisodona múltiples, eventualmente limpiar entre en con 70% de etanol, y se inyecta la buprenorfina (diluido en PBS) por vía subcutánea a 0,1 mg / kg de concentración como preventivo analgésico. Usando unas tijeras finas, realizar un corte longitudinal de 2 cm de la piel y, posteriormente, de la pared subyacente muscular para acceder a la cavidad peritoneal. Vierta en la ca cavidad peritoneal. 2ml de solución de IUE (D-PBS que contenía 100 U / ml de penicilina / estreptomicina) precalentado a 37 ° C y mantener la solución en un bloque de calentamiento. </li><li> Cubra el ratón con drap estéril que contiene una grieta de la que se retira el útero. Retirar la incisión con un retractor de tungsteno, identificar el útero y tire de ella sujetándola con pinzas entre embriones adyacentes (Figura 1B; izquierda) y, finalmente, se tendió en el drap estéril. Durante toda la operación, enjuagar el útero con solución de IUE para hidratar la cavidad de órganos y el cuerpo y prevenir la deshidratación del animal. </li><li> Maneje con cuidado el útero lo sostiene entre los dedos pulgar e índice y gire un embrión hasta que su cabeza es visible y orientada hacia el operador. Identificar los hemisferios telencefálicas e inyectar uno de ellos desde el lado dorso-lateral. Liberar 1-2 l de la solución de ADN usando el interruptor de pie de un PicoPump hasta el ventrículo se describe por FastGreen (Figura 1B; derecha). </li><li&gt; Colocar el ánodo de los electrodos en el sitio de la inyección y el cátodo en el lado contralateral (Figura 1C) y entregar 6 pulsos de 30 V durante 50 ms con 950 ms intervalo entre cada pulso usando un electroporador generar de forma cuadrada campos eléctricos de uso a través de un pedal. Evite colocar los electrodos cerca de la placenta, ya que puede causar hemorragias y daño al embrión. </li><li> Cuando todos los embriones son inyectados y electroporación, colocar el útero en la cavidad abdominal y cerrar las paredes musculares con una cadena de sutura para suturar cada 3-4 mm. Los nudos debe ser ajustado para el músculo, pero no demasiado apretado para permitir una ligera hinchazón del tejido. Por último, cierre la piel que lo recubre con clips metálicos. Desinfecte la piel con Betaisodona, quitar el ratón de la máscara de isoflurano y la transfiere en una jaula de la vivienda cuando está completamente despierto. Controlar la recuperación del ratón hasta que el comportamiento locomotor es normal. </li></ol> 2. Tratamiento de la sample <ol><li> Uno o más días después de la electroporación, sacrifica el ratón, recoger los embriones e identificar aquellas correctamente electroporación utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Figura 1D). Diseccionar el cerebro en PBS enfriado en hielo, y fijar durante la noche en 4% PFA (paraformaldehído en tampón de fosfato pH 7,4). Eventualmente, BrdU se puede administrar antes de sacrificio de acuerdo a diferentes paradigmas para investigar la cinética del ciclo celular y la proliferación celular 3. </li><li> Los cerebros se procesan entonces para seccionar y la inmunotinción para los varios marcadores de la glía radial, progenitoras basal y las neuronas (Pax6, nestina, Tbr2, Tbr1, Tuj1 etc) para evaluar el efecto de los transgenes funcionales en específica NSC y su progenie que son identificado por la expresión del gen indicador co-electroporada. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1.En la electroporación in utero. (A) Representación esquemática de una plataforma en el útero de la electroporación. (B) los planos que muestran el posicionamiento del ratón embarazada durante la cirugía (a la derecha) y la inyección de la mezcla de ADN / FastGreen (azul) en el hemisferio telencephalic de un embrión de ratón (izquierda). (C) Esquema que muestra la colocación de los electrodos en contacto con las paredes del útero con el ánodo (+) adyacente al sitio de inyección (azul). Las flechas indican la migración del ADN hacia el ánodo. (D) Imagen de un embrión de ratón de 24 horas después de la electroporación con plásmidos GFP en el día embrionario 13. La línea de puntos delimita el hemisferio telencephalic. Esquema de una modificación de Calegari et al., 2004 17. Parte 2: Ampliación del Consejo de Seguridad Nacional de Adultos 1. Producción de derivados del VIH partículas virales <ol><li> Día 1: placa de 5 x 10 6 células 293T en una de 10 cmplato con 8 ml de D-MEM que contiene 10% de inactivado por calor suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina (medio de cultivo). Utilice 15 platos para una preparación viral y la cultura durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Día 2: para cada plato, se diluye en 1 ml de D-MEM llano 5 g de cada uno de los 3 plásmidos que codifica para i) VSVG (tipo de virus de la estomatitis vesicular G) proteína de la envoltura, ii) gag / pol (antígeno específico de grupo / polimerasa) , y iii) un polycistronic construcción que expresa los transgenes funcionales y reportero (es decir cdk4/cyclinD1/GFP) previamente clonado en un vector de transferencia basado en VIH-(p6NST90) 9. Mezclar esta solución con 1 ml de D-MEM que contiene 45 l de polietilenimina que se ha disuelto previamente en PBS a 1 mg / ml de solución madre, y se incuba durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, eliminar los medios de comunicación de las células y añadir 4 ml por placa de D-MEM fresco que contiene 15% de inactivado por calor suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina. Añadir el m 2l de mezcla de transfección y cultivo durante la noche. </li><li> Día 3: añadir 120 l de 500 mM Na-butirato por placa para mejorar la expresión de los transgenes, mezclar suavemente y cultura para 6-8 horas después de que reemplazar el medio de transfección con 5 ml de medio de cultivo. </li><li> Día 4: recoger los sobrenadantes (ca. 70 ml en total), pasar a través de un filtro de 0,22 micras y transferencia en 2 tubos de centrífuga de polialómero (35 x 89 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. Desechar el sobrenadante, añadir 6 ml de PBS a cada tubo e incubar en hielo durante 1 hr. Resuspender el precipitado y transferirlo en un tubo de centrífuga de polialómero (14 x 95 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 50 l de PBS, hacer 5 ml de alícuotas y se almacena a -80 ° C. Título viral estará en el rango de 10 -10 8 9 ufc / ml. (Nota: los virus son muy sensibles a la temperatura y el almacenamiento avoIdentificación del re-congelación, mantener en hielo seco durante el transporte y descongelar poco antes de su uso.) </li></ol> 2. Inyección estereotáxica <ol><li> Anestesiar a un ratón 6-10 semanas de edad con isoflurano y colocar el animal en posición prona en un marco estereotáxico (Figura 2A) con las barras de soporte del oído y el paladar para fijar correctamente la cabeza. El animal se mantiene caliente en una almohadilla térmica a 37 ° C y bajo la administración de isoflurano constante. </li><li> Inyectar por vía subcutánea 100 l de solución de trabajo buprenorfina como preventivo analgésico, afeitar una banda de piel de la cabeza del ratón, y desinfectar, como se describe en 1,4. El uso de un bisturí, hacer una ca. 1,5 cm de largo incisión longitudinal en la piel de la cabeza exponer el cráneo a nivel de la sutura sagital. Retirar la piel y limpie suavemente la superficie del hueso con un bastoncillo de algodón estéril. </li><li> La mitad de llenar un vaso capilar (especificaciones de 1,2) con aceite de parafina y montarlo en la bomba de inyección de insertarel capilar hasta que el segundo anillo (Figura 2B). Mueva el soporte capilar en el eje x, y y z hasta que la punta del capilar se coloca en el bregma, el punto de conjunción entre las suturas sagital y lateral (figura 2C) (a ser determinado con la ayuda de un microscopio binocular), y re-conjunto x, y, y z valores a 0. </li><li> Mueva el capilar por ± 1,6 mm en el eje medio-lateral (x) y -1,9 mm en el eje anterior-posterior (y) y marcar el hueso usando un lápiz marcador quirúrgico. Hacer un agujero de aprox. 0,5 mm de diámetro en el cráneo utilizando un perforador eléctrico teniendo cuidado de no dañar el cerebro. </li><li> Poner una gotita de 5 l de suspensión viral (1 parte alícuota) en un trozo de Parafilm colocan en las barras del oído y sumergir la punta del capilar en la gotita. Suck ca. 3,5 l de suspensión viral usando un inyector nanoliter fijada en 55 nl / seg. Ejecutar este paso rápidamente a medida que la gotita se evapore. </li><li> Mueva el capilar al sitio of inyección y moverlo hacia abajo hasta que la punta toca la superficie pial. Cambiar el valor del eje dorso-ventral (z) a 0. En este punto, penetrar en el tejido con el capilar de -1,9 mm y suelte 1,5 l de suspensión viral a una velocidad de 4 nl / s. Espere 2-3 minutos para minimizar el flujo de retorno de la cubeta de suspensión viral de la pista capilar y luego retraer el capilar. Una segunda inyección se puede realizar en el hemisferio contralateral. </li><li> Suturar la piel, desinfectar, y permitir que el animal se recupere de la anestesia como se describe anteriormente en el útero para electroporación (1,8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Inyección estereotáxica viral. (A y B) Representación esquemática de los componentes necesarios para realizar la inyección estereotáxica (A) y un soporte desmontado capilar que muestra la inserción de un capillary hasta que el segundo anillo (B). (C) Imagen de la cabeza de ratón inmovilizado por las barras para los oídos y el apoyo paladar con la piel cortada para exponer el cráneo (a la izquierda). La ampliación del cuadro de puntos (derecha) muestra las suturas laterales y sagital, el bregma, y ​​el sitio de la inyección (círculo). 3. Procesamiento de la muestra <ol><li> Uno a tres semanas después de la infección, perfundir el ratón con ca. 100 ml de 4% de PFA, diseccionar el cerebro y posfijo de toda la noche en 4% de PFA. Eventualmente, BrdU y / o el tamoxifeno se puede administrar antes de sacrificio de acuerdo a diferentes paradigmas para investigar la cinética del ciclo celular y para detener la expresión de los transgenes virales flanqueado por sitios loxP, respectivamente 9. </li><li> Entonces, el cerebro pueden ser procesados ​​para inmunotinción usando varios marcadores de células madre y progenitoras y las neuronas (por ejemplo, Sox2, GFAP, nestina, Tbr2, doublecortin, etc). </li></ol>

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BA y FC ha presentado una solicitud de patente que describe la expansión condicional de las células madre adultas somáticas por cdk4/cyclinD1 virus (EP 10160288.6).

Un paso crítico para la electroporación en el útero es la calidad y pureza del ADN desde su migración direccional durante la entrega de los campos eléctricos depende de su carga. Los protocolos de purificación de ADN que no incluyen la eliminación de nuevas moléculas cargadas, tales como las endotoxinas, puede conducir al enmascaramiento de los cargos de ADN naturales negativos que conducen a una mala dispensación. Claramente, tocando las paredes del útero con los electrodos tan cerca como sea posible del área a ser objeto mejorará la eficiencia de la electroporación. Igualmente importante es la calidad de los electrodos utilizados ya que esto es fundamental para la entrega de los campos eléctricos óptimos. Los micro-arañazos ni siquiera es visible por el ojo y / o residuos orgánicos, tales como trazas de suero, lípidos, y así sucesivamente, inevitablemente se acumulan con el tiempo conduce a electrodos perder sus propiedades. Electropes viejos y / o sucios son la causa más probable de una repentina caída en la eficiencia de la electroporación y, por lo tanto, debe ser replaced tan pronto como esta se nota. Aunque es relativamente simple, la electroporación in utero por lo general requiere de varias semanas de entrenamiento con el fin de lograr de manera satisfactoria y resultados reproducibles. Esta técnica es muy versátil ya que se puede aplicar, virtualmente, a cualquier órgano y tejido del embrión en desarrollo. Ciertamente, los órganos que contienen una cavidad, tal como el cerebro, son particularmente fáciles de orientar y permitir una alta proporción de células transfectadas debido a la facilidad de inyectar un volumen relativamente grande de ADN. Un problema común encontrado en el establecimiento de inyección estereotáxica viral es tener pocas células infectadas y / o para dirigirse a áreas no deseadas. El primer problema se asoció principalmente con la inyección de bajo título de virus. Células 293T con menor número de pases en cultivo crecen más rápido y dar lugar a mayores títulos virales. El uso de células mayores de ca. 20 pasajes no se recomienda y medio de transfección con una eficiencia inferior al 80% no se asegurará un buenproducción viral. La resuspensión del sedimento viral es también crítico, la suspensión viral tiene que aparecer grupos homogéneos y viral que podría ocluir el capilar tienen que ser evitados. Los virus son muy sensibles a la temperatura desciende y el almacenamiento a largo plazo. Por estas razones, las alícuotas necesitan ser permanentemente almacenados a -80 ° C y no se puede volver a congelar. Incluso en estas condiciones, una disminución en la infectividad se puede observar después de 6-12 meses de almacenamiento. En las fases de aprendizaje, sugerimos probar el título viral de cada preparación viral y volver a hacerlo después de un almacenamiento a largo plazo. La presencia de células infectadas en zonas no deseadas del cerebro puede depender de un posicionamiento óptimo de la cabeza del ratón en el marco estereotáxico, que requiere algo de práctica. Además, es fundamental para no dañar la superficie del cerebro, mientras que la apertura del agujero en el cráneo, porque de lo contrario no será posible restablecer el 0 correctamente en la superficie pial, resultando en la inyección impreciso. Las coordenadasque se proporciona en este protocolo se refiere a las mujeres C57/BL6 6-10 semanas de edad y se sugiere que la optimización de cepa diferente / edad / sexo. La adquisición de esta técnica puede requerir más tiempo que en el útero de la electroporación debido a las fases más largos necesarios para preparar los virus y analizar las muestras. Es muy recomendable que los virus sólo se utilizan después de la cirugía del ratón y la inyección estereotáxica se han convertido en fiable y reproducible. El primer paso para lograr esto es inyectar células permeantes colorantes de ADN, tales como Hoechst 33342, en los ratones sacrificados y analizar los cerebros inmediatamente. En la electroporación in utero y la inyección estereotáxica viral son dos potentes sistemas a aguda y tejidos específicamente manipular la expresión de genes en el SNC durante el desarrollo de los mamíferos y la edad adulta. A pesar de su limitación en la selección de sólo una subpoblación de células, estos sistemas proporcionan una velocidad sin precedentes y facilidad en comparación con métodos más convencionales, in particular, la generación laborioso y tiempo de ratones transgénicos. Sin embargo, a pesar de esta similitud, existen varias diferencias entre las dos técnicas que son dignas de mención. En primer lugar, con respecto a la focalización de los diferentes tipos de células, la electroporación in utero inicialmente conduce a la transfección de células madre adecuadas (también llamadas células gliales radiales) porque estas son las únicas células que delimitan el ventrículo donde se inyecta el ADN. Como resultado de divisiones celulares, los plásmidos que posteriormente será heredado de células diana, madre madre a su progenitor y / o células neuronales hija que conducen a la redistribución de las células transfectadas en toda la corteza como una función del tiempo. En contraste, el uso de los lentivirus VIH en el cerebro adulto conduce a la infección simultánea de cualquier tipo de células incluyendo las células madre, progenitoras, las neuronas maduras, así como células gliales. De nota, con respecto al uso de lentivirus VIH en comparación con los retrovirus más comúnmente utilizados es el hecholentiviral que la integración se produciría independientemente del estado mitótico de las células, permitiendo así que el objetivo también de adultos, las células madre latentes. En segundo lugar, otra diferencia importante entre la electroporación y la infección viral es que una expresión transitoria, episomal se consigue por el anterior en lugar de la integración irreversible de ADN en el genoma de las células infectadas obtenidos por este último. Como resultado de divisiones celulares consecutivas, la dilución de los plásmidos electroporados, y la degradación de la proteína CyclinD1 ectópico, se produciría en cada ciclo celular. Por lo tanto, la expansión de NSC durante el desarrollo embrionario se demostró que sólo duran aproximadamente dos días 15 mientras que en el cerebro adulto este efecto se encontró que dura varios meses (resultados no publicados). En tercer lugar, ya que i) cdk4/cyclinD1 tiene un efecto más fuerte en las células con un G1 más y ii) cometidos progenitores neurales durante el desarrollo de un ciclo celular más largoque las células madre mientras que lo contrario ocurre durante la edad adulta, nuestros dos manipulaciones se encuentra a desencadenar la expansión, sobre todo, de los progenitores neurales durante el desarrollo de las células madre y en la edad adulta. En cualquiera de los casos un aumento en neuronas se ha logrado por ambos métodos. Cuarta inyección, viral se puede realizar fácilmente, fiable y reproducible, en muchas regiones diferentes del cerebro adulto, simplemente cambiando las coordenadas estereotáxica. En contraste, la orientación precisa de determinadas regiones del sistema nervioso central, tales como tallo cerebral, formación del hipocampo o la médula espinal, por electroporación en el útero podría ser más difícil de lograr reproducible. Además, mientras que la inyección estereotáxica se puede realizar en ratones de cualquier edad, un rendimiento óptimo de la electroporación en el útero está limitada de aproximadamente E11 a E16. Etapas previas a E11 requeriría o bien el uso de un microscopio de retrodispersión de ultrasonidos 18,19 o un culto embrión enteroure sistema de 17,20. Recientemente, un creciente interés en la biología celular básica de células madre somáticas se ha promovido porque su estudio y manipulación se cree que es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias basadas en células regenerativas. En particular, para la sobreexpresión de cdk4/cyclinD1, nuestro protocolo proporciona los medios para aumentar transitoriamente la expansión de NSC en vivo (Figura 3B y C y 4B y C) con el fin de aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro adulto. Creemos que estos manipulación puede ser importante en un número de contextos diferentes para comprender mejor el papel de NSC en el desarrollo del cerebro, la evolución y la homeostasis así como su contribución a la función cognitiva o la recuperación de la degeneración neural o lesión.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / equipo </td><td> Proveedor </td><td> Catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Endofree kit maxi plásmido </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brown pipeta extractor </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Capilares de borosilicato con filamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tabla animales de laboratorio top anestesia sistema </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 cuentas de vidrio esterilizador </td><td> Southpointe quirúrgica </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris fórceps </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona solución </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pico de la bomba </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 electroporador onda cuadrada </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Electrodos de pinzas redondas </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Material de sutura </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> Reflejoaplicador de clips para cerrar heridas </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de inyección Temgesic </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax I- </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal de Bovin </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de tejido </td><td> Halcón </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimina 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> ácido n-butírico, sal sódica </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Tube, espesores, polialómero </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Modelo 900 animal pequeño instrumento estereotáxico </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI pico microscopio </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 controlador y el inyector Nanoliter2000 </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio reemplazo 3,5 nanolitros </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR taladro general de aplicación </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Anticuerpo </td><td> Proveedor </td><td> Catálogo </td><td> Dilución </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Tabla de anticuerpos. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Células madre somáticas se pueden dividir para generar células madre adicionales (expansión) o tipos de células más diferenciadas (diferenciación), que es fundamental para la formación de tejidos durante el desarrollo embrionario y la homeostasis del tejido durante la edad adulta 1. Actualmente, se invierten grandes esfuerzos hacia el control del interruptor de las células madre somáticas de la expansión a la diferenciación porque este se cree que es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias para el 1,2 medicina regenerativa. Sin embargo, un reto importante en el estudio y el uso de células madre somáticas es que su expansión se ha demostrado ser muy difícil de controlar. Aquí se describe un sistema que permite el control neural de la madre / progenitoras de células (en conjunto denominado NSC) de expansión en la corteza de embriones de ratón o el hipocampo adulto mediante la manipulación de la expresión del complejo cdk4/cyclinD1, un importante regulador de la fase G1 del ciclo celular y de células madre somáticas differentiation 3,4. En concreto, dos enfoques diferentes son descritos por la que el complejo cdk4/cyclinD1 se sobreexpresa en NSC in vivo. Por el primer enfoque, la sobreexpresión de los reguladores del ciclo celular se obtiene mediante la inyección de plásmidos que codifican para cdk4/cyclinD1 en el lumen del telencéfalo ratón seguido por electroporación en el útero para entregarlos a NSC de la corteza lateral, por lo tanto, la activación de la expresión episomal transgenes 5-8. Por el segundo método, altamente concentrados derivados del VIH virus se inyectaron estereotáxicamente en el giro dentado del hipocampo del ratón adulto, por lo tanto, provocando la expresión constitutiva de los reguladores del ciclo celular después de la integración del constructo viral en el genoma de las células infectadas 9. Ambos enfoques, cuyos principios básicos fueron ya descritos por otros protocolos de vídeo 10-14, se optimizaron para i) reducir los daños en los tejidos, ii) porciones deseadas de todo el cerebro muy específicas regions, iii) obtener un alto número de células manipuladas dentro de cada región, y iv) provocar altos niveles de expresión de los transgenes dentro de cada célula. La sobreexpresión transitoria de los transgenes utilizando los dos enfoques se obtiene por diferentes medios es decir, por dilución natural de los plásmidos electroporados debido a la división celular o la administración de tamoxifeno en Cre que expresan NSC infectados con virus que transportan cdk4/cyclinD1 flanqueado por sitios loxP, respectivamente 9,15 . Estos métodos proporcionan una plataforma muy poderosa para manipular tejido agudamente y específicamente la expresión de cualquier gen en el cerebro de ratón. En particular, mediante la manipulación de la expresión del complejo cdk4/cyclinD1, nuestro sistema permite el control temporal de la expansión NSC y su interruptor a la diferenciación, por lo tanto, en última instancia, el aumento del número de neuronas generadas en el cerebro de los mamíferos. Nuestro enfoque puede ser de importancia crítica para la investigación básica y el uso de células madre somáticas para la terapiade los mamíferos del sistema nervioso central mientras que proporciona una mejor comprensión de i) detener contribución a la formación de tejido de células durante el desarrollo, ii) la homeostasis del tejido durante la edad adulta, iii) el papel de la neurogénesis adulta en las funciones cognitivas, y quizás, iv) mejor usando madre somáticas células en modelos de enfermedades neurodegenerativas.

<ol><li> En general, en el útero de la electroporación produce 60-80% de los embriones electroporated muestran una fuerte expresión del gen informador en una amplia zona de la corteza lateral (Figura 3A). Las proteínas fluorescentes se puede detectar fácilmente en embriones de todo el montaje tan pronto como 3-6 horas después de la cirugía con la señal que dura más de una semana. Dentro de la zona específica, de aproximadamente 30-50% de las células normalmente expresan el transgén (s) con la proporción de células que co-expresan dos (o más) co-electroporadas transgenes siendo normalmente por encima de 90% (Figura 3B, a la izquierda) 6,8 , 15. Mientras que un nivel mínimo de apoptosis (ca. 2.0-2.5%) se observó después de aproximadamente 2 horas de la electroporación, este valor se vuelva a los niveles fisiológicos (ca. 0.5-1.0%) después de aproximadamente 6 horas (FC, datos no publicados). La proporción de embriones o ratones embarazadas morir debido a la cirugía es típicamente insignificante (&lt;5%). Co-electroporación con cdk4/cyclinD1 bajo estas condiciones seguido por 48 horas de desarrollo provoca un aumento en la expansión de células progenitoras neurales en un 30% (Figura 3B, a la derecha, y C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Expansión de progenitores neurales por cdk4/cyclinD1 sobreexpresión. (A) Imagen de fluorescencia de una sección a través de la corteza lateral de un embrión de ratón 24 horas después de la electroporación con GFP y RFP plásmidos en el día embrionario 13. (B) las imágenes fluorescentes como en una 48 horas después de co-electroporación con plásmidos cdk4/GFP y cyclinD1/RFP y inmunomarcación para el marcador progenitor basal Tbr2. Reporteros fluorescentes con DAPI counterstainig (izquierda) y Tbr2 (derecha) se muestran. Líneas indica la superficie apical de la zona ventricular (VZ; línea blanca) y los límites de la zona subventricular (SVZ; amarillas líneas discontinuas). Tenga en cuenta el aumento de thickness de la SVZ en la porción electroporado de la corteza (puntas de flecha blanca) debido a un aumento de la generación y la expansión de progenitores basales después de la sobreexpresión de cdk4/cyclinD1. (C) Cuantificación del efecto se muestra en B. Bares = SD, p &lt;0,05, n = 3. Gráfico de barras en C se toma de Lange et al., 2009 15. <ol start="2"><li> Después de la inyección estereotáxica viral, ca. 80% de los ratones operados por mostrar una fuerte expresión de los transgenes en toda la circunvolución dentada conjunto. La expresión constitutiva de GFP se puede detectar fácilmente en las secciones 40 micras tan pronto como 4 días después de la cirugía. A lo largo del eje rostral a caudal de la circunvolución dentada, alrededor del 10-30% de las células (equivalente a un total de ca. 10,000-30,000 células) normalmente expresan el transgén (s) (Figura 4A) 9. La proporción de ratones que mueren debido a la cirugía es insignificante (&lt;5%). Tres semanas sobreexpresión de cdk4/cyclinD1 bajo estas condiciones provoca un aumento de NSC en más de dospliegues (Figura 4B), mientras que la disminución de la neurogénesis en un 70% (Figura 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Efectos de la infección viral. (A) reconstrucción en 3D de 7 imágenes de fluorescencia tomadas de 40 m de espesor de serie de secciones coronales (1 recoger cada 6) a lo largo del eje rostral a caudal del hipocampo. GFP + células infectadas (verde) y la tinción nuclear con DAPI (azul) de la circunvolución dentada se muestran (arriba). Imágenes de campo claro de las secciones coronales correspondientes a los mostrados en A (centro) y la representación en 3D (abajo) de todo el hemisferio cerebral con el hipocampo resaltados en verde pseudocolor (modificado a partir del Atlas Allen Brain; <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Las flechas blancas señalan el sitio de la inyección. Lateral (L), rostral (R), y dorsal (D) ejes (x, y, y z estereotáxica coordenadas) se indican (a la derecha). (B y C) Proporción de nestin + NSC (B) y DCX + neuronas recién nacidas (C) dentro de la población de GFP + células infectadas por 3 semanas después de la inyección estereotáxica de las buenas prácticas agrarias (blanco) o cdk4/cyclinD1/GFP virus (negro). Barras = SD, p &lt;0,005, n = 3. Los gráficos en B y C tomado de la Artegiani et al., 2011.

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Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.7K vistas.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

En Vivo Reprogramación Directa de Células Gliales Residentes en Interneuronas por Inyección Intracerebral de Vectores Virales

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...