Este protocolo se puede utilizar para analizar los mecanismos de división celular en el contexto del tejido vivo e intacto utilizando microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que se conservan los entornos fisiológicos nativos de las células, al tiempo que se permiten imágenes en vivo durante cursos de mucho tiempo. La parte más importante de esta técnica es asegurarse de que los testículos no están dañados durante la disección o montaje.
Esta es una habilidad que se adquiere con un poco de tiempo y práctica. La demostración visual de este método es crítica, ya que muestra cómo identificar y aislar los testículos, y cómo montarlos para la toma de imágenes sin dañar el tejido. Preparar animales, herramientas y medios como se describe en el manuscrito.
Antes de comenzar la disección, utilice la jeringa de filtro llena de medios para expulsar tres gotas de soporte cada 50 microlitros en la parte superior, media e inferior de un portaobjetos de vidrio. Usando una sonda de disección, transfiera de cinco a 10 larvas instar o pupas tempranas a la gota superior de medios en el portaobjetos. Agitar suavemente las larvas y pupas en los medios con la sonda de disección para eliminar cualquier alimento o escombros.
Utilice la sonda de disección para girar una sola larva o pupae de lado. Busque los dos testículos bilaterales que aparecen como estructuras ovaladas translúcidas en el tercio posterior del cuerpo. Los animales que carecen de testículos son hembras y deben desecharse.
Cuando se encuentre una larva o pupa macho y esté limpio, muévalo a la segunda gota de medios. Repita hasta que tres o cuatro larvas masculinas o pupas hayan sido transferidas a la segunda gota de medios. Luego, trabajando en la segunda gota de medios, agarra un solo animal con un par de fórceps en su región media, justo antes de los testículos.
Use un segundo par de fórceps para desgarrar suavemente al animal por la mitad. Usando un par de fórceps, sostenga el extremo posterior del animal hacia abajo en el portaobjetos de vidrio. Comenzando justo al lado de los fórceps, empuje hacia abajo en la cutícula usando el borde del bisturí.
Mueva el bisturí hacia el extremo cortado del animal. Esto expulsará los órganos internos del animal, que incluyen las tripas, los cuerpos gordos y los testículos. Los testículos son órganos ovalados incoloros y casi transparentes incrustados en cintas de cuerpo graso.
Separe suavemente los testículos del resto de los órganos. Para transferir los testículos de uno en uno, inserte el borde del bisturí debajo del cuerpo graso, levante el tejido fuera del medio y muévalo rápidamente a la tercera gota. Si no hay suficiente cuerpo de grasa todavía unido a los testículos para levantar el tejido con el bisturí, utilice una pipeta Pasteur de vidrio que se ha prewetted con medio de disección.
Trabajando en la tercera gota de medio, utilice el extremo afilado del bisturí para cortar suavemente el exceso de grasa del cuerpo de los testículos, dejando sólo un pequeño borde de cuerpo de grasa alrededor de los bordes. En primer lugar, utilice la jeringa del filtro para depositar una sola gota del medio de Schneider alrededor de 30 microlitros en el centro de un plato de cultivo permeable al gas de 50 milímetros. Usando la herramienta de bisturí o una pipeta Pasteur preequipada transfiera hasta cinco de los testículos preparados a la gota en el plato.
A continuación, utilice la herramienta de bisturí para empujar suavemente los testículos hacia abajo sobre la membrana permeable al gas, y en el centro de la gota de medio. Con una jeringa de un mililitro, coloque cuatro gotas de aceite de halocarbono en la membrana permeable al gas que rodea la caída del medio. Las ubicaciones de las gotas deben corresponder a las cuatro esquinas de un cubreobjetos de clase de 22 milímetros.
A continuación, alinee las esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros con las cuatro gotas de aceite de halocarbono y baje suavemente el cubreobjetos sobre el medio y el aceite. Deje que el cubreobjetos se asiente, y para los medios que contienen los testículos el spread entre las gotas de aceite. Coloque el plato de cultivo bajo un microscopio de disección.
Para eliminar el exceso de medios, inserte la esquina de una delicada limpieza de tareas debajo del cubreobjetos. Wick lejos suficientes medios para el cubreobjetos de vidrio para simplemente hacer contacto con la superficie de los testículos más grandes. No retire demasiados medios y baje el cubreobjetos demasiado lejos.
Esto ejercerá presión sobre los testículos y puede hacer que se rompan. Por último, coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos de vidrio justo encima de los testículos. Dé la vuelta al plato y colóquelo en la etapa del microscopio.
Mueva el objetivo del microscopio de 40 o 60 X al aceite hasta que esté justo debajo de los testículos. Utilice la luz transmitida para encontrar un solo testículo y enfocarlo en el foco. Coloque 0,5 mililitros de 8%paraformaldehído en PBSTx en un pozo de un plato de nueve pozos diseccionados.
Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir hasta 10 de los testículos al pozo. Asegúrese de que los testículos están acostados en la parte inferior del pozo. Después de 20 minutos, transfiera los testículos a un pozo que contenga 0,5 mililitros de PBSTx.
Lave los testículos agitando suavemente durante cinco minutos. Lavar dos veces más en nuevos pozos con PBSTx fresco. Preparar una dilución del anticuerpo primario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como se describe en el manuscrito.
A continuación, transfiera los testículos de la placa de disección de vidrio de nueve pozos al tubo. Incubar el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados con suave balanceo o nuez. El procedimiento para tinr los testículos con el anticuerpo secundario es similar.
Consulte el manuscrito para obtener más información. En primer lugar, con una pipeta Pasteur, transfiera los testículos de la placa de nueve pozos a un portaobjetos de vidrio. Si es necesario, utilice el borde del bisturí para empujar los testículos hacia abajo sobre la superficie de la diapositiva.
A continuación, utilice la esquina de una delicada toallita de tarea para eliminar el exceso de líquido de los testículos. Retire la mayor cantidad de líquido posible. A continuación, aplique una caída de 30 a 50 microlitros del medio de montaje de la microscopía a los testículos.
Por último, coloque un cubreobjetos de 22 milímetros en la caída del medio de montaje. Deje que el cubreobjetos se asiente, y el medio de montaje se extienda debajo del cubreobjetos. Si es necesario, aplique una presión suave en el cubreobjetos para exprimir el exceso de medio de montaje y deje reposar el cubreobjetos sobre la superficie de los testículos.
Cuando este protocolo se ejecuta correctamente, se conserva la organización celular de los testículos y la progresión de la diferenciación celular de un extremo del testículo al otro es visible. Los esperocitos a punto de comenzar la meiosis y los de la metafase pueden ser identificados. En los testículos preparados con este protocolo, el análisis de imágenes en vivo muestra la reorganización dinámica del retículo endoplasmático y los micro túbulos en la división de los esperatocitos.
Como se describe en el protocolo, se debe tener mucho cuidado de no aplicar presión que haga que los testículos estallen. Los quistes de espermatozoides fluyen rápidamente de un testículo roto, lo que dificulta la toma de imágenes de lapso de tiempo en vivo. Este protocolo está optimizado para la división de imágenes de espermatozoides en tejido vivo e intacto.
Por lo tanto, es esencial que los testículos no se dañen durante la disección o montaje. Nuestro método también debe ser adecuado para técnicas de imágenes de superrescía, como la microscopía de iluminación estructurada, proporcionando nuevos conocimientos sobre los procesos subcelulares dinámicos que rigen la división celular.
