Name: dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Lindsey W. Plasschaert y Justin Sui por sus contribuciones sustanciales al desarrollo temprano de este protocolo. Los autores agradecen a la comunidad de moscas por su generosidad con los reactivos, y en particular a Ruth Lehmann y Benjamin Lin por su regalo de la línea nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' antes de su publicación. En este estudio se utilizaron las existencias obtenidas del Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabajo fue apoyado por NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 y R35GM136270 (S.D), así como por becas de capacitación T32GM007229 (B.W.) y F32GM125123 (L.A.).

1. Preparación del día antes de la disección
<ol><li>Afila electrolíticamente una aguja de tungsteno24 para que el diámetro resultante sea de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste el voltaje suministrado a aproximadamente 14 V y use 3.3 M NaOH. El afilado no debe tomar más de 1 o 2 minutos. PRECAUCIÓN: El NaOH es altamente corrosivo y causará quemaduras al contacto con la piel. Use guantes y gafas mientras manipula, y trabaje dentro de una campana extractora. NOTA: Después de su uso, guarde NaOH en un tubo Falcon de polipropileno.</li>
	<li>Haga los medios de imagen preparados. En un tubo cónico de 15 ml, combinar 4,25 ml de medios de Schneider con 750 μL de suero fetal bovino (FBS, concentración final del 15%) y 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de penicilina, concentración final de 0,05 μg/μL). Guarde este medio de imagen preparado a 4 °C.</li>
	<li>Haga una solución de heptano-pegamento. Agregue aproximadamente 0,5 ml de heptano a un vial sellable de 20 ml relleno con cinta adhesiva de doble cara de unos 20 cm. Mece en un nutator durante aproximadamente una hora, o revuelva con una punta de pipeta hasta que se logre una consistencia entre la del agua y el glicerol. Esta solución de pegamento disuelto durará varios días antes de que el heptano se evapore. Para refrescar la solución, agregue 0.5 ml de heptano adicional y roca. NOTA: Se puede preparar una solución efectiva de heptano-pegamento utilizando varias proporciones de heptano a cinta, así como diferentes duraciones de balanceo / agitación. Las especificaciones anteriores son simplemente sugerencias para preparar o refrescar una de esas soluciones adecuadas.</li>
</ol>2. Recolección de embriones: 15–17 h antes de la disección
<ol><li>Agregue pasta de levadura fresca a un plato de agar de jugo de manzana25. Instale una jaula de recolección de embriones agregando moscas adultas (de menos de 10 días de edad) a una botella de alimento vacía, perforada con pequeños orificios26. Tapa la jaula de recolección con la placa de agar con levadura, pegada a la botella, y coloca la jaula con el lado de la placa hacia abajo en una incubadora oscura de 25 °C durante 1 h. NOTA: Las moscas deben expresar un transgén que marcará fluorescentemente la gónada, por ejemplo, six4-eGFP::Moesin20, porque la disección de embriones se llevará a cabo bajo un microscopio estereofresor. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los genotipos utilizados para marcar la gónada.</li>
	<li>Retire la jaula de la incubadora y deseche esta primera colección. Reemplácelo con una placa de agar recién levadura y vuelva a colocar la jaula en la incubadora durante 2 h. NOTA: La primera colección de embriones se utiliza para limpiar a las hembras de embriones fertilizados en desarrollo, para lograr una segunda colección de embriones estrechamente programada.</li>
	<li>Retire la placa de agar de la jaula y colóquela (con el lado de levadura hacia arriba) sobre una toalla de papel húmeda dentro de un recipiente de plástico sellable. Coloque esta cámara húmeda en una incubadora de 25 °C para envejecer los embriones durante 14,5 h (edades finales, 14,5-16,5 h después de la puesta del huevo). NOTA: Inmediatamente antes de comenzar el paso 2.4, complete los pasos 3.1 y 3.2.</li>
	<li>Retire la placa de agar de la incubadora y, con una botella de chorro, agregue suficiente agua a la placa de agar para disolver la pasta de levadura cepillando ligeramente con un pincel. Enjuague los embriones y la levadura disuelta en una pequeña cesta de malla de malla que se encuentra dentro de un bote de pesaje. Enjuague la cesta con la botella de chorro de agua hasta que la mayor parte de la pasta de levadura se haya filtrado a través de la malla.</li>
	<li>Retire el agua del bote de pesaje y vuelva a colocar la cesta dentro. Descoronar los embriones sumergiéndolos en una solución de lejía al 50%, utilizando un frasco de chorro. La solución de lejía debe tener una profundidad de 3–5 mm. Mantenga los embriones sumergidos en lejía durante ~ 2 minutos, con remolinos ocasionales. PRECAUCIÓN: La lejía es corrosiva y puede irritar o dañar los ojos y el tracto respiratorio. Use guantes y gafas mientras manipula la lejía. NOTA: Durante este tiempo, complete tanto como sea posible el paso 3.3. El progreso de la descororonación se puede verificar colocando la canasta bajo un microscopio estereoscópico y verificando la ausencia de los apéndices dorsales. Sumerja los embriones en la solución de lejía durante más tiempo, si es necesario.</li>
	<li>Deseche la lejía y enjuague bien los embriones dentro de la canasta con agua de una botella de chorro (durante ~ 3 s, seque la canasta de malla con toallas de papel; repita 2-3 veces).</li>
</ol>3. Preparación del día de la disección
<ol><li>Añadir 30 μL de insulina (10 mg/ml) a 1.500 μL de soporte de imagen preparado (ver paso 1.2) en un tubo de Eppendorf de 1,5 ml (concentración final de 0,2 mg/ml). Mezcle bien y deje el tubo en la mesa de trabajo para equilibrar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare tiras de funda recubiertas con pegamento.<ol>
<li>Use un cuchillo con punta de diamante para cortar un trozo de cubierta de 22 mm x 22 mm en cuatro tiras de igual tamaño (Figura 1A).</li>
		<li>Use fórceps para recoger una tira y extienda un total de aproximadamente 30 μL de solución de pegamento de heptano a ambos lados de la tira (Figura 1B). Para lograr una capa uniforme de residuos de pegamento, incline la tira en varios ángulos mientras el heptano se evapora.</li>
		<li>Guarde la tira cubierta de pegamento en una ranura vacía de una caja de cubierta; para mantener su pegajosidad, coloque la tira en una posición inclinada, pero vertical, apoyada contra los bordes de la caja para minimizar el contacto con las superficies de la caja (Figura 1C). Cierre la caja para que las partículas en el aire no cubran el pegamento y disminuyan su pegajosidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los siguientes elementos en la mesa de trabajo: una pipeta Pasteur de vidrio de 6 pulgadas, un portaobjetos de microscopio, un pipetador P200 y un P1000 con las puntas de pipeta apropiadas, la solución de Ringer27 (pH ajustado a 7.3 con NaOH) y un plato de imágenes de 35 mm cubierto con recubrimiento de poli-D-lisina.</li>
	<li>Transfiera embriones de la cesta de malla a un pequeño vaso de reloj lleno de heptano de 500 a 750 μL.<ol>
<li>Seque los lados y la parte inferior de la cesta con una toallita de pañuelos. Humedezca un pincel en el heptano, toque el pincel en los embriones (la membrana vitelline hidrofóbica debe adherirse a las cerdas) y sumerja el pincel de nuevo en el heptano en el vidrio del reloj (los embriones deben hundirse hasta el fondo). NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse lo más rápido posible para evitar que los embriones se sequen. Los embriones no deben exponerse al aire durante más de 20 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera los embriones al portaobjetos del microscopio utilizando una pipeta Pasteur (Figura 1D). Extraiga los embriones en la pipeta lentamente y limítelos a la porción estrecha de la pipeta. Los embriones de pipeta en la diapositiva lentamente, de modo que se agregan justo dentro de la punta de la pipeta antes de fluir hacia la diapositiva. Gire la esquina de una toallita de tejido en una punta fina y elimine el heptano de los embriones en el portaobjetos. Se agregarán y cubrirán un área más pequeña, lo que facilitará su captura en una tira cubierta de pegamento en el siguiente paso.</li>
	<li>Con fórceps, tome una tira cubierta de pegamento y tóquela suavemente con los embriones (Figura 1E). Coloque la tira en el plato de imágenes, de lado del embrión hacia arriba y justo afuera del centro recubierto de poli-D-lisina. Presione la tira sobre el plato con fórceps, para asegurarse de que esté fija en su lugar. Inmediatamente inunde el plato con la solución de Ringer de 2 a 3.5 ml; sumergir primero los embriones para evitar que se sequen (Figura 1F).</li>
</ol>4. Disección
NOTA: Estos pasos deben llevarse a cabo bajo un microscopio estereofresor.
<ol><li>Desvitellinizar 10-15 embriones. NOTA: Esto puede variar desde dos embriones, para principiantes, hasta quince embriones, para expertos.<ol>
<li>Seleccione embriones en etapa 16 según la morfología intestinal (Figura 2). En esta etapa, los embriones tienen tres constricciones intestinales que crean cuatro segmentos intestinales apilados (Figura 2B, B'). Para comenzar la desvitellinización, perfore el embrión seleccionado en un extremo, preferiblemente el anterior, con la aguja de tungsteno. El embrión puede salir de su membrana vitelina, pero si no, pelar la membrana del embrión. NOTA: Los embriones que son demasiado jóvenes para diseccionar tienen intestinos no regionalizados (Figura 2C). La disección de embriones en etapa 17 es posible, pero más desafiante que la disección de embriones en etapa 16 porque la cutícula está comenzando a desarrollarse en esta etapa. Los embriones de la etapa temprana 17 presentan cuatro segmentos intestinales que se desplazan entre sí (Figura 2D, D').</li>
		<li>Engancha la aguja a través del embrión en una región alejada de las gónadas. Transfiera el embrión enganchado a la región recubierta de polilisina del plato (de aquí en adelante, simplemente "deslizamiento de cubierta") y arrástrelo contra el fondo hasta que se adhiera. Repita estos pasos y organice los embriones desvitellinizados en una fila a lo largo de la parte superior de la hoja de cubierta recubierta de polilisina (Figura 3A), dejando mucho espacio debajo para una mayor disección. NOTA: Las gónadas aparecen como pequeños agregados esféricos de células que deben fluorescenciar intensamente, dependiendo del marcador específico utilizado y el número de copias transgénicas. En esta etapa, las gónadas se encuentran lateralmente en el segmento A5, aproximadamente en el 70% -80% de la longitud del embrión desde la parte anterior. A lo largo del protocolo de disección, el tejido puede adherirse a la aguja. Para eliminar la aguja de los escombros, levántela justo por encima de la superficie de la solución de Ringer. La desvitellinización puede ser desordenada siempre y cuando la gónada propiamente dicha se altere lo menos posible.</li>
	</ol></li>
	<li>Afinar las gónadas fuera del embrión y en el plato (Figura 3C, D).<ol>
<li>Primero, filetear el embrión para exponer su interior (Figura 3C). Cortar a través del embrión desde su centro, moviendo la aguja hacia atrás, entre las gónadas. Desentraña un poco de tejido interno, ya que esto se pegará al plato mucho mejor que la cutícula externa. La pegajosidad del tejido permitirá que las siguientes manipulaciones revelen la gónada y le permitan adherirse al deslizamiento de la cubierta. NOTA: Si el tejido no se adhiere al plato, intente persuadirlo a una región no contaminada del resbalón de la cubierta recubierta; las regiones exteriores del deslizamiento de la cubierta serán particularmente pegajosas. Como se indica en el paso 4.1.2, no importa si las manipulaciones de disección dan como resultado un cadáver embrionario destrozado, siempre y cuando las gónadas permanezcan ilesas.</li>
		<li>Use la aguja para cortar alrededor de una gónada hasta que un pedazo de tejido, incluida la gónada, se separe de la carcasa restante. Con la aguja, dibuje este tejido a una región fresca de deslizamiento de cubierta recubierta y engatúelo contra la parte inferior hasta que se adhiera al plato. NOTA: La mejor imagen se logrará para aquellos casos en los que la gónada se adhiere directamente al deslizamiento de la cubierta, en lugar de la unión indirecta a través del tejido suprayacente. Por lo tanto, a medida que el tejido se aleja de la carcasa, intente que la gónada toque primero el deslizamiento de la cubierta, en lugar de tejido extraño.</li>
		<li>Retire la mayor cantidad posible de tejido circundante de la gónada (Figura 3D) arrastrando suavemente el tejido adherente lejos de la gónada con la aguja. Evite tocar la gónada directamente, lo que la dañaría (Figura 4E). Para asegurarse de que la gónada esté lo suficientemente adherida al plato, mueva la aguja en un movimiento circular suave alrededor de la gónada; si se mueve, toque la aguja con el tejido adherente restante y dirija la gónada hacia una región fresca de deslizamiento de cubierta pegajosa. Repita este proceso hasta que no haya un movimiento detectable de la gónada.</li>
		<li>Regrese al cadáver embrionario y diseccione la segunda gónada. Repita este proceso en tantos embriones como sea posible, pero NO exceda los 25 minutos. La viabilidad del tejido se verá comprometida en la solución de Ringer después de más de ~ 40-45 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez completadas las disecciones, use un marcador indeleble para agregar marcas de registro al borde exterior de la placa de imágenes para registrar su orientación durante la disección.</li>
	<li>Retire la tira recubierta de pegamento del plato.<ol>
<li>Inserte suavemente la punta inferior de un par de pinzas debajo de la tira, cierre e incline lentamente la tira hacia arriba para liberarla del plato con el menor chapoteo posible de la solución de Ringer para minimizar la perturbación de las gónadas adheridas. NOTA: La tira debe inclinarse lejos de las gónadas disecadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Lleve suavemente el plato al microscopio de imágenes de una manera que evite el chapoteo de la solución de Ringer.</li>
</ol>5. Imágenes
<ol><li>Coloque el plato de imágenes en el soporte del escenario, utilizando las marcas de registro para colocar el plato en la orientación aproximada como durante la disección. Usando microscopía de campo brillante y un objetivo de baja potencia (~ 10x), identifique y enfoque cualquier pieza de tejido que esté adherida al deslizamiento de la cubierta. Cambie la configuración del ocular para revelar la fluorescencia y, utilizando los oculares binoculares, escanee sistemáticamente el plato, marcando la posición de cada gónada dentro del software de imágenes (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Asegúrese de que las gónadas estén centradas en el campo de visión antes de marcar posiciones.</li>
	<li>Retire suavemente todo el conjunto del soporte del escenario, con el plato de imágenes en su soporte, y coloque el conjunto en el banco de trabajo.</li>
	<li>Reemplace la solución de Ringer por el soporte de imagen preparado que contenga insulina (ver pasos 1.2 y 3.1).<ol>
<li>Use un P1000 para quitar toda la solución de Ringer de la repisa superior interior del plato de imágenes (no pipetee Ringer de la región de deslizamiento de la cubierta central). A continuación, cambie a un P200 y coloque su punta justo debajo de la superficie del Ringer restante en la región central. Retire cuidadosamente 50–100 μL de Ringer; NO quite toda la solución.</li>
		<li>Dibuje ~ 200 μL de medios de imagen y, nuevamente colocando la punta P200 justo debajo de la superficie del Ringer restante, agregue lentamente este medio de imagen. A continuación, agregue los medios de imagen restantes (~ 1,300 μL) al plato, comenzando en el borde más externo de la repisa superior. Mientras pipetea, muévase hacia la cúpula central del fluido y, finalmente, fusione los dos cepillando la punta de la pipeta a través de ambos. Coloque la tapa en el plato. NOTA: Los soportes de imagen deben cubrir todo el diámetro interior del plato, con una profundidad de aproximadamente 2 mm, para evitar la evaporación (Figura 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cambie el microscopio a un objetivo de mayor potencia (63x, 1.2 NA), aplique el fluido de inmersión adecuado según el objetivo utilizado (tipo de fluido de inmersión e índice de refracción requerido por el objetivo) y luego reemplace el conjunto del soporte de la etapa. Use microscopía de campo brillante para enfocar el tejido adherido a la parte inferior de la placa de imágenes. NOTA: Si la etapa no se movió, la última gónada debe aparecer a la vista una vez que el objetivo está enfocado.</li>
	<li>Pase por cada posición marcada de la gónada y ajuste esa posición, según sea necesario. Seleccione qué gónadas desea obtener una imagen en función de la claridad de la imagen, el sexo de las gónadas, etc. Personalice la configuración de imagen (multicanal, tiempos de exposición, intensidades láser, incrementos de la serie Z, lapso de tiempo con intervalos apropiados, etc.). Comience a tomar imágenes. NOTA: Las gónadas masculinas se pueden identificar por la presencia de un nicho y, en el extremo opuesto de la gónada, un grupo de células somáticas pequeñas y altamente circulares llamadas precursores gonadales somáticos específicos del hombre (msSGP). Si se utiliza el marcador fluorescente six4-eGFP::moesin, las células de nicho son las segundas células más brillantes de la gónada, siendo las más brillantes las msSGP. En esta etapa, las gónadas femeninas no tienen ni un nicho ni msSGPs.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante la gonadogénesis, la gónada embrionaria, y particularmente el nicho de células madre dentro de la gónada masculina15, sufre cambios morfológicos rápidos. Los mecanismos de desarrollo que subyacen a estos cambios dinámicos se entienden mejor a través de técnicas de imágenes en vivo. Sin embargo, en la etapa embrionaria 17, las imágenes in vivo de la gónada se vuelven imposibles por el inicio de contracciones musculares a gran escala17. Con este p...

El Drosophila melanogaster testis ha servido como paradigma para nuestra comprensión de muchos procesos celulares dinámicos. Los estudios de este modelo han arrojado luz sobre la regulaciónde la división de células madre 1,2,3, el desarrollo de células germinales 4,5, la biología de piRNA 6,7,8 y los eventos de señalización de células madre de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo es ventajoso porque es genéticamente tratable14,15 y es uno de los pocos en los que podemos vivir células madre en su entorno natural 3,16,17,18. Sin embargo, la imagen en vivo de este modelo se ha limitado al tejido adulto y a las etapas embrionarias tempranas, dejando un vacío en nuestro conocimiento de la dinámica gonadal en el embrión tardío, la etapa precisa en la que el nicho se está formando por primera vez y comienza a funcionar.
La gónada embrionaria en etapa tardía es una esfera, que consiste en células de nicho somáticas en la parte anterior, y células germinales enquistadas por células gonadales somáticas en las regiones más posteriores19. Este órgano puede ser fotografiado en vivo in vivo hasta la etapa embrionaria temprana 17 17,20,21. Se previenen más imágenes debido al inicio de contracciones musculares a gran escala. Estas contracciones son tan severas que empujan la gónada fuera del marco de la imagen, y tal movimiento no se puede corregir con el software de imágenes. Nuestro laboratorio está interesado en revelar los mecanismos de formación de nichos, que ocurre durante este período difícil de alcanzar para las imágenes en vivo. Por lo tanto, generamos un enfoque ex vivo para obtener imágenes en vivo de la gónada a partir de la etapa embrionaria 16, facilitando el estudio de la dinámica celular durante este período crucial de desarrollo de la gónada. Trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que esta imagen ex vivo recapitula fielmente el desarrollo de gónadas in vivo 17. Esta técnica es la primera y única de su tipo para la gónada embrionaria de Drosophila.
Aquí, presentamos el protocolo de disección requerido para la obtención de imágenes en vivo ex vivo de la gónada durante las etapas embrionarias tardías. Este protocolo se puede combinar con tratamientos farmacológicos o manipulación transgénica de linajes celulares específicos dentro de la gónada. Usando esta técnica, hemos fotografiado con éxito los pasos de la formación de nichos de células madre17. Este enfoque de imagen es, por lo tanto, instrumental para el campo de la biología de células madre, ya que permitirá la visualización de las etapas iniciales de la formación de nichos en tiempo real dentro de su entorno natural15,17. Si bien este método es beneficioso para el campo de la biología de células madre, también es aplicable para visualizar cualquier proceso dinámico que ocurra en la gónada durante este punto de tiempo de desarrollo, incluidos los reordenamientos celulares22, la adhesión celular 2,12,23 y la migración celular23. Este protocolo de disección mejorará así nuestra comprensión de muchos procesos biológicos celulares fundamentales.

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar Tungsten wire</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster:&lt;/em&gt; His2Av::mRFP1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner, &amp;amp; Heidmann, Current Biology, 2007</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: nos&lt;/em&gt;-lifeact::tdtomato</td><td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, &amp;amp; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#039;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin&lt;/em&gt;</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano et al., PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Diamond-tipped knife</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Imaging dish</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td></tr><tr><td>Insulin, bovine</td><td>Sigma</td><td>l0516</td><td>Store aliquots at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&amp;rsquo;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Media</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

La gónada embrionaria masculina de Drosophila melanogaster es un modelo ventajoso para estudiar varios aspectos de la biología del desarrollo, incluidos, entre otros, el desarrollo de células germinales, la biología de piRNA y la formación de nichos. Aquí, presentamos una técnica de disección para obtener imágenes en vivo de la gónada ex vivo durante un período en el que las imágenes en vivo in vivo son altamente ineficaces. Este protocolo describe cómo transferir embriones a un plato de imágenes, elegir embriones masculinos en etapas adecuadas y diseccionar la gónada de su tejido circundante mientras se mantiene su integridad estructural. Después de la disección, las gónadas se pueden obtener imágenes utilizando un microscopio confocal para visualizar los procesos celulares dinámicos. El procedimiento de disección requiere un tiempo y una destreza precisos, pero proporcionamos información sobre cómo prevenir errores comunes y cómo superar estos desafíos. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo de disección para la gónada embrionaria de Drosophila , y permitirá la obtención de imágenes en vivo durante una ventana de tiempo que de otro modo sería inaccesible. Esta técnica se puede combinar con manipulaciones transgénicas farmacológicas o específicas de tipo celular para estudiar cualquier proceso dinámico que ocurra dentro o entre las células en su entorno gonadal natural.

Ilustramos la preparación del plato de imágenes en la Figura 1, como se describe en "Preparación del día de la disección". En última instancia, estos métodos deberían dar como resultado embriones bien hidratados adheridos a una tira deslizante de cubierta, que se fija temporalmente al fondo del plato y se sumerge en la solución de Ringer (Figura 1F). Un cuchillo con punta de diamante permite cortar limpiamente un deslizamiento de cubierta de 22 x 22 mm ...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.2K vistas.  University of Pennsylvania. Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biología

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Imágenes de explantes cerebrales vivos de larvas de Drosophila melanogaster en el tercer estadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor destacado: Investigación de la dinámica de la división celular asimétrica: un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de explantes cerebrales de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

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Live-proyección de imagen de la

A largo plazo de imágenes en vivo

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila

La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches