Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP al desarrollo de esta técnica.

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.
1. Preparación de líneas celulares
<ol><li>Cultivar líneas celulares de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular del laboratorio para el cultivo celular tradicional o la inyección en ratones. Los protocolos estándar utilizados aquí son el crecimiento en el medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina / estreptomicina (en lo sucesivo conocido como medio de crecimiento completo). NOTA: En este experimento, las células de osteosarcoma de Abrams se utilizan en ratones Balb/c Foxn1 nu/nu . Para los estudios de cáncer de mama, se utilizan células 4T1 en ratones Balb/c y células EO771 en ratones C57BL/6.</li>
	<li>Cultivar células en frascos de cultivo de tejidos ventilados o en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos a 37 °C con un 5% deCO2.</li>
	<li>Pasar la línea celular de interés y preparar las células para la inyección cuando las células alcanzan una confluencia comúnmente utilizada con la inyección de estas células en ratones.</li>
</ol>2. Animales
<ol><li>Use ratones Balb/c Foxn1 nu/nu al menos de 6-8 semanas de edad para la generación de tumores subcutáneos para asegurarse de que los animales están más allá de la fase de crecimiento rápido y han alcanzado la edad adulta y la madurez esquelética.</li>
	<li>Use ratones machos o hembras. Haga excepciones al seleccionar líneas celulares sensibles a las hormonas (por ejemplo, células de cáncer de mama en ratones hembra y células de cáncer de próstata en ratones machos).</li>
	<li>Para experimentos de xenoinjertos, use ratones desnudos atímicos inmunodeficientes basados en que la línea celular es incompatible con un sistema inmune de ratón intacto en condiciones normales.</li>
	<li>Para experimentos de aloinjertos utilizando líneas celulares murinas, esto también se recomienda en función de diferentes antecedentes genéticos e inmunes de ratón. Sin embargo, para experimentos singénicos, use animales de la misma cepa que la línea celular de interés.</li>
	<li>Animales domésticos en densidades estándar dependiendo de las políticas de cría de la institución.</li>
</ol>3. Tumores subcutáneos
<ol><li>Cosechar líneas celulares de cultivo mediante tripsinización y resuspender en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Evaluar la viabilidad celular y determinar la densidad celular mediante el método de exclusión de azul de tripano. Use un hemocitómetro o un contador celular automatizado para contar las células. Se debe utilizar una viabilidad celular mínima del 90% para inyección en ratones para crear tumores subcutáneos.</li>
	<li>Ajuste la densidad celular para inyectar 1-2 x 105 células en un volumen final de 0.1 a 0.15 ml (100 a 150 μL) de PBS estéril. Mantenga las células en hielo hasta la inyección.</li>
	<li>Alternativamente, las células de pellet por centrifugación a 800 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células peletizadas en un medio de matriz de membrana basal estéril sin diluir para obtener 1-2 x 105 células en un volumen final de 0,1 a 0,15 ml (100 a 150 μL). Mantenga las células en hielo hasta que se sigan usando.</li>
	<li>Anestesiar ratones para ser utilizados para el crecimiento tumoral subcutáneo con isoflurano en anestesia con oxígeno. Utilizar una dosis de inducción de isoflurano al 5% en 2 L/min de oxígeno y una dosis de mantenimiento de 2-3% de isoflurano en 2 L/min de oxígeno. Compruebe la falta de reflejos de parpadeo o pedal antes de continuar. NOTA: El isoflurano es un anestésico inhalatorio. Use isoflurano en un área bien ventilada con sistemas apropiados de recolección de gases libres y eliminación. Consulte con el personal veterinario institucional para desarrollar un plan para la inducción, mantenimiento y monitoreo de la anestesia, y asegúrese de que el personal del laboratorio tenga la capacitación adecuada en el monitoreo de la anestesia y el manejo de agentes anestésicos inhalantes.</li>
	<li>Retire el vello de la región dorsal del tórax o el abdomen de ratones anestesiados con solución depilatoria o con un cortapelos eléctrico. Se prefiere la solución depilatoria para minimizar el trauma potencial en la piel. Omita este paso si usa ratones desnudos atímicos.</li>
	<li>Limpie el área preparada con un hisopo de etanol al 70% antes de la inyección de la suspensión celular.</li>
	<li>Use una jeringa de tuberculina de 1 ml con una aguja de 27 G para inyectar células por vía subcutánea sobre la región dorsal del tórax o el abdomen, para que no se vean afectadas por el movimiento de los omóplatos. Alternativamente, inyecte las células por vía subcutánea como una suspensión en la matriz extracelular disponible comercialmente. NOTA: La inyección en la matriz extracelular disponible comercialmente limitará la migración de la suspensión celular en el espacio subcutáneo porque estas matrices se solidifican a temperatura ambiente.</li>
	<li>Recuperar los ratones en una almohadilla térmica en jaulas individuales hasta que sea ambulatorio. Los ratones pueden ser colocados en sus jaulas normales con ropa de cama limpia y seca.</li>
	<li>Monitorear el tamaño del tumor subcutáneo que recubre el tórax dorsal o el abdomen con un calibrador y medir el peso corporal semanalmente para asegurar que los tumores subcutáneos no se ulceren o que los ratones cumplan con los criterios de extracción temprana establecidos por el comité de cuidado y uso de animales de las instituciones. Se recomienda un tamaño máximo del tumor de 15 mm en cualquier dimensión para reducir el riesgo de ulceración cutánea o necrosis tumoral central. NOTA: Consulte las pautas locales para determinar el tamaño/volumen máximo permisible del tumor.</li>
	<li>Eutanasia a ratones portadores de tumores subcutáneos después de tres a cuatro semanas por inhalación deCO2 seguida de luxación cervical. Siga las políticas aceptables de la institución para la eutanasia de ratón.</li>
	<li>Cosechar tumores subcutáneos mediante técnica quirúrgica aséptica. Esterilice la piel que recubre el tumor como antes con etanol al 70% después de la eliminación del vello (si corresponde). Incide a través de la piel que recubre el tumor con una hoja de bisturí # 15 (con o sin un mango de hoja de bisturí). Diseccionar bruscamente el tumor de los tejidos blandos adjuntos circundantes con un par de tijeras quirúrgicas estériles.</li>
	<li>Coloque el tumor en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos que contengan un medio de crecimiento completo y pique en múltiples fragmentos pequeños de tamaño predeterminado (~ 0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm – 0.25 mm 3 hasta 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm3) con una hoja de bisturí #15 (con o sin mango de hoja de bisturí).</li>
	<li>Mantener los fragmentos tumorales en medio de crecimiento completo estéril a temperatura ambiente hasta el momento de la implantación intratibial. Para las líneas celulares que portan luciferasa o genes reporteros fluorescentes, use imágenes bioluminiscentes o fluorescentes ex vivo para confirmar la viabilidad del tumor antes de la implantación intratibial en ratones.</li>
	<li>Para la criopreservación, coloque múltiples fragmentos en el mismo criovial en un medio de crecimiento completo suplementado con 20% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar gradualmente utilizando un sistema de criopreservación comercial a –80 °C y almacenar a largo plazo en nitrógeno líquido. Preservar los fragmentos tumorales para su posterior análisis, pero no para su futura implantación, mediante congelación rápida mediante inmersión en nitrógeno líquido. Almacene estos fragmentos tumorales congelados a largo plazo a –80 °C. NOTA: Se ha informado previamente que los tumores congelados a presión no se injertan y crecen in vivo8.</li>
</ol>4. Implantación quirúrgica de fragmentos tumorales subcutáneos
<ol><li>Llevar los fragmentos frescos o criopreservados del tumor subcutáneo a temperatura ambiente en un medio de crecimiento completo antes de la implantación quirúrgica.</li>
	<li>Anestesiar ratones de la cepa de interés utilizando isoflurano en anestesia con oxígeno como se describe en la Sección 3. Compruebe la falta de reflejos del pedal antes de continuar. Administrar buprenorfina subcutánea a una dosis de 0,02-0,05 mg/kg para proporcionar analgesia perioperatoria. Esto se puede repetir cada 6-8 h en el período postoperatorio, si es necesario.</li>
	<li>Elimine el vello de la articulación de la rodilla derecha y la tibia proximal de la extremidad posterior con una solución depilatoria para minimizar el posible trauma en la piel.</li>
	<li>Frote el área preparada con antiséptico quirúrgico. Frote primero con un hisopo de etanol al 70% y luego frote con clorhexidina alterna y exfoliante salino.</li>
	<li>Visualice la tibia proximal como la región distal a la articulación de la rodilla mientras flexiona y extiende la articulación.</li>
	<li>Cree una incisión de 3-4 mm a nivel de la tibia proximal en la cara medial de la extremidad con una hoja de bisturí # 15 (con o sin mango de hoja de bisturí). Incisar a través de la piel y el tejido subcutáneo para exponer la corteza medial de la tibia proximal.</li>
	<li>Aplique una presión suave con la punta de una aguja de 25 G, mientras gira la punta, para crear un pequeño orificio en la corteza medial de la tibia proximal. Haga este orificio aproximadamente 2 mm distal a la articulación de la rodilla en un punto equidistante entre las cortezas tibiales craneal y caudal. Seleccione el tamaño de la aguja según el tamaño de los fragmentos del tumor.</li>
	<li>Use fórceps estériles para recoger e insertar los fragmentos tumorales en la cavidad medular de la tibia proximal. Use una aguja de 27 a 30 G para manipular el fragmento tumoral en el canal medular. Dependiendo del tamaño de los fragmentos del tumor, implante un mínimo de 0,5 mm3 de volumen tumoral total en cada tibia. Esto puede requerir la implantación de 1 o más fragmentos tumorales dependiendo del tamaño de los fragmentos tumorales creados. NOTA: Las modificaciones para prevenir o limitar el desplazamiento del injerto fuera del hueso serían la colocación de cera ósea o cemento óseo en el defecto óseo o espuma de gel o un injerto de grasa subcutánea sobre el orificio en el hueso.</li>
	<li>Coloque los bordes de la piel con adhesivo de tejido líquido estéril o una sola sutura de piel. No utilice clips para heridas en este sitio. Tenga cuidado si utiliza imágenes de fluorescencia en el período postoperatorio, ya que tanto los adhesivos tisulares como la sutura tienen el potencial de fluorescer.</li>
	<li>Recuperar los ratones en una almohadilla térmica en jaulas individuales hasta que sea ambulatorio.</li>
</ol>5. Evaluación en serie y de punto final
<ol><li>Anestesiar ratones usando isoflurano en anestesia con oxígeno como se describió anteriormente.</li>
	<li>Evaluar el crecimiento del tumor tibial de forma no invasiva mediante radiografía digital semanal, bioluminiscencia o imágenes de fluorescencia (si se utilizan células que expresan luciferasa o un gen reportero fluorescente). Las mediciones de calibre de la extremidad en el sitio de implantación también se pueden realizar en ratones despiertos.</li>
	<li>Además del monitoreo tradicional de ratones portadores de tumores (peso corporal, nivel de actividad, frecuencia respiratoria, aseo, postura, mentalidad y comportamiento), monitoree a los ratones semanalmente para detectar signos de cojera de las extremidades posteriores, hinchazón e infección del sitio quirúrgico.</li>
	<li>Controle la herida quirúrgica de la piel durante los primeros 10-14 días para detectar enrojecimiento excesivo, hinchazón, drenaje y dehiscencia de la herida hasta que la herida cutánea se cure. Después de 4-5 semanas, evalúe a los ratones de acuerdo con la evaluación de los resultados del estudio, ya sea vivos o después de la eutanasia.</li>
</ol>

<ol>
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El Dr. Hildreth fue financiado por el NIH bajo el número de premio K01OD026527.  El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

Este informe documenta nuestro modelo para crear tumores óseos primarios o metástasis óseas después de la implantación intratibial de un aloinjerto tumoral. Creemos que hay varios pasos críticos en este proceso. Se debe establecer un plano anestésico seguro tanto para la inyección subcutánea de la suspensión de células tumorales como para la colocación intratibial de los fragmentos tumorales resultantes. Debe haber una preparación estéril del sitio quirúrgico tanto para la extracción del aloinjerto subcut...

Los modelos de ratón de enfermedades humanas y animales son cada vez más populares en la investigación biomédica. La utilidad de usar ratones en este contexto es que su anatomía y fisiología son muy similares a las de los humanos. Tienen un período de gestación relativamente corto y un tiempo en la vida postnatal para alcanzar la madurez, y se asocian en gran medida con un costo relativamente bajo y facilidad de vivienda, aunque los crecientes costos de desarrollo o compra se asocian con mayores grados de modificación genética, inmunodeficiencia y / o humanización1. El uso de cepas endogámicas da como resultado una población animal en gran medida uniforme antes de la inclusión en el estudio. Un conocimiento completo de su genoma sugiere un alto grado de similitud con los humanos. Se han identificado objetivos moleculares ortólogos para muchos procesos de enfermedad en el genoma del ratón y ahora existe una extensa biblioteca de reactivos específicos para ratones que se pueden obtener fácilmente. Por lo tanto, brindan la oportunidad de un análisis de rendimiento relativamente alto de una manera más rápida y menos costosa en comparación con los modelos animales más grandes1. Además, con el advenimiento de estrategias de edición genética que permiten la sobreexpresión o eliminación de ciertos genes, ya sea globalmente o de una manera específica del tipo celular y / o constitutivamente o de manera inducible, representan un sistema modelo muy útil biológicamente para la investigación de enfermedades humanas y animales2.
El cáncer es un campo en el que los modelos de ratón tienen una gran utilidad. Los modelos genéticos de cáncer en ratones se basan en la modulación de la expresión de oncogenes o genes supresores de tumores, solos o en combinación, para que las células experimenten una transformación oncogénica. También se realiza la inyección de líneas celulares tumorales primarias o establecidas en ratones. La introducción de líneas celulares o tejidos de humanos u otras especies animales, incluidos ratones, sigue siendo el modelo de cáncer in vivo más utilizado. El uso de células y tejidos de especies disímiles (xenoinjertos) en ratones inmunocomprometidos se realiza con mayor frecuencia2. Sin embargo, el uso de células tumorales de aloinjerto o tejidos donde tanto el huésped como el receptor son de la misma especie permite la interacción con un sistema inmune intacto cuando se combina con la misma cepa de ratón huésped en sistemas singénicos3.
Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos dan lugar a lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas, dolorosas 3,4. Estos tumores comprometen la estructura ósea, aumentando el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. En pacientes con cáncer de mama, el hueso es el sitio más común de la primera metástasis y el primer sitio de presentación más frecuente de la enfermedad metastásica 5,6. Además, las células tumorales diseminadas (DTC) están presentes en la médula ósea antes del diagnóstico y predicen el desarrollo de metástasis en otros órganos7. Por lo tanto, se cree que las células cancerosas presentes en el hueso son la fuente de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. Existen muchos modelos de ratón de metástasis tumorales sólidas que desarrollan metástasis predominantemente en el pulmón y los ganglios linfáticos, y dependiendo del tipo de tumor y la técnica de inyección, potencialmente otros sistemas de órganos3. Sin embargo, faltan modelos de metástasis ósea en ratones que produzcan metástasis esqueléticas específicas del sitio de manera confiable y reproducible y desarrollen metástasis óseas antes de que los ratones alcancen los criterios de eliminación temprana de la carga tumoral primaria o metástasis a otros órganos. Hemos reportado un modelo del osteosarcoma tumoral óseo primario que se basa en la implantación quirúrgica de un aloinjerto tumoral sólido en la tibia proximal de ratones8. Los tumores óseos se formaron en el 100% de los ratones y el 88% desarrollaron metástasis pulmonar. Esta incidencia de metástasis excede lo que comúnmente se informa clínicamente en personas (~ 20-50%), pero es de gran interés ya que el pulmón es el sitio más común de metástasis para el osteosarcoma 9,10,11. Si bien este modelo es ventajoso para modelar tumores óseos primarios, también tiene una gran utilidad para modelar metástasis óseas de otros tumores sólidos osteotrópicos como tumores de mama, pulmón, próstata, tiroides, hígado, riñón y gastrointestinales.
La justificación para el desarrollo de este modelo fue desarrollar una alternativa a la inyección intraósea tradicional típicamente en la tibia proximal o el fémur distal para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas12. Nuestro objetivo principal era aliviar una limitación conocida de esta técnica, es decir, la embolización tumoral del pulmón. Esto resulta en el injerto de estas células tumorales embólicas y "metástasis artificarias" que no recapitulan la cascada metastásica completa de un tumor óseo primario establecido que hace metástasis a los pulmones 8,13. Esta también sería la situación cuando una metástasis ósea establecida se propaga a un sitio distante. Además, esta técnica también se desarrolló para producir un modelo de metástasis ósea que asegurara una mayor incidencia de injertos y crecimiento de tumores en hueso y en un sitio uniforme en comparación con las técnicas de inyección ortotópica o intravascular. Este modelo tiene claras ventajas sobre estas técnicas descritas. Este modelo implica la administración controlada y consistente de células tumorales en el hueso. También evita la metástasis pulmonar artifactual después de la embolización pulmonar y establece una población de estudio uniforme basal. Existe el beneficio de los tumores específicos del sitio con este modelo sin el riesgo de criterios de extirpación temprana resultantes de tumores primarios o metástasis a otros órganos. Por último, este modelo tiene una gran utilidad para la modificación, incluyendo el uso de xenoinjertos derivados de pacientes.
El modelo presentado tiene similitudes con la inyección directa de suspensión celular en el hueso siguiendo un enfoque quirúrgico seguido de inyección a través de la corteza o la administración en la cavidad medular después de hacer un pequeño defecto en la corteza (con o sin escariado de la cavidad medular)8,14,15,16,17 . Sin embargo, la implantación de un aloinjerto tumoral hace que esta técnica sea claramente diferente. Por lo tanto, el propósito de este informe fue demostrar este modelo de tumores óseos primarios y metástasis óseas de tumores sólidos, que supera muchas limitaciones de los modelos descritos anteriormente. Los grupos de investigación con experiencia en cultivo celular, modelos de ratón, anestesia y cirugía de ratón y anatomía de ratón están bien equipados para reproducir nuestra técnica para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas en ratones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#15 scalpel blade</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>75614</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10578911</td>
			<td>Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrams osteosarcoma cell line</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal weighing scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c nude mouse (nu/nu)</td>
			<td>Charles River Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>6-8 weeks of age. Male or female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Depuy Synthes</td>
			<td>160504</td>
			<td>Optional use instead of bone wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W31G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Animalcare Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide euthanasia station</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Should be provided within animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator set at 37 &#176;C and 5% carbon dioxide</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Various</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>411412</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (2 ml)</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin (Firefly), potassium salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>500-181-30</td>
			<td>Can be manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microradiography cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics, LLC</td>
			<td>MX-20</td>
			<td>Optional to evaluate bone response to tumor growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1371171000</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2483</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11200-33</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (&#8211; 80 &#176;C)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-794C</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11704939</td>
			<td>Can also use automated cell counter, if available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles (27 gauge)</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>DIS55510</td>
			<td>May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>1182098</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher scientifc</td>
			<td>25030081</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>British Oxygen Corporation</td>
			<td>NA</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen dewar, 5 litres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TY509X1</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#174; Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Optional. Also available in 10 ml size (354230)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002549</td>
			<td>Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing containiner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10110051</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td>Can alternatively use an electric clipper with fine blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #7 Short</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>10007-12</td>
			<td>User preference as long as it accepts #15 scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heated pad</td>
			<td>VetTech</td>
			<td>HE006</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>GT Vision Ltd.</td>
			<td>H600BV1</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (sterile)</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td>84-1469SB</td>
			<td>Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5250061</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Use 0.05%-0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>Slip tip preferred over Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vented tissue culture flasks, T-75</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CLS3290</td>
			<td>Can also use smaller or larger flasks, as needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone

Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos producen lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas. Estas lesiones comprometen la estructura ósea, aumentan el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que con muchos tumores sólidos, las células cancerosas que se han diseminado al hueso pueden ser la fuente principal de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. La mayoría de los modelos de ratón singénico o xenoinjerto de tumores óseos primarios implican la inyección intraósea (ortotópica) de suspensiones de células tumorales. Algunos modelos animales de metástasis esqueléticas de tumores sólidos también dependen de la inyección ósea directa, mientras que otros intentan recapitular pasos adicionales de la cascada metastásica ósea inyectando células por vía intravascular o en el órgano del tumor primario. Sin embargo, ninguno de estos modelos desarrolla metástasis óseas de forma fiable o con una incidencia del 100%. Además, se ha demostrado que la inyección intraósea directa de células tumorales está asociada con una posible embolización tumoral del pulmón. Estas células tumorales embólicas se injertan pero no recapitulan la cascada metastásica. Se informó un modelo de ratón de osteosarcoma en el que se implantan fragmentos tumorales frescos o criopreservados (que consisten en células tumorales más estroma) directamente en la tibia proximal mediante una técnica quirúrgica mínimamente invasiva. Estos animales desarrollaron injertos reproducibles, crecimiento y, con el tiempo, osteólisis y metástasis pulmonares. Esta técnica tiene la versatilidad de ser utilizada para modelar metástasis óseas tumorales sólidas y puede emplear fácilmente injertos que consisten en uno o múltiples tipos de células, células genéticamente modificadas, xenoinjertos derivados de pacientes y / o células marcadas que pueden rastrearse mediante imágenes ópticas o avanzadas. Aquí, demostramos esta técnica, modelando tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso.

Un resultado positivo se asociaría con el injerto tumoral y el crecimiento tumoral progresivo a lo largo del tiempo. Dependiendo del tipo de tumor, el crecimiento tumoral intraóseo puede estar asociado con cojera progresiva de las extremidades posteriores, pero muchos tumores no causan cojera a pesar de los signos de enfermedad ósea concomitante. El injerto exitoso se documentó con imágenes avanzadas, por lo que habría cambios radiográficos, μCT o μMRI progresivos en la tibia proximal asociados con el fenotipo ?...

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Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.

Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

modeling-primary-bone-tumors-bone-metastasis-with-solid-tumor-graft

Research

JoVE Journal

Cancer Research

2.6K vistas.  University of Alabama at Birmingham. Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.

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Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are available for studying the significant crosstalk; however, a two-dimensional transwell system for coculture remains a classic, reliable, and easy way for this crosstalk study. Here, we present a detailed protocol that shows the coculture of bone marrow adipocytes and melanoma cells. Nevertheless, such a coculture system could not only contribute to the study of cell signal transductions of cancer cells induced by bone marrow adipocytes, but also to the future mechanistic study of bone metastasis which may reveal new therapeutic targets for bone metastasis.

Here, we present a reliable and straightforward two-dimensional (2D) coculture system for studying the interaction between tumor cells and bone marrow adipocytes, which reveals a dual effect of melanoma cell-derived factors on the bone marrow adipocytes differentiation and also poses a classic method for the mechanistic study of bone metastasis.

Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular interactions that exist within this microenvironment. Yet the BM microenvironment cannot be easily replicated in vitro, which potentially limits the physiologic relevance of many in vitro and ex vivo experimental models. These issues can be overcome by utilizing a xenograft model in which luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cells will specifically engraft in the mouse skeleton. When these mice are given the appropriate substrate, D-luciferin, the effects of therapy on tumor growth and survival can be analyzed by measuring changes in the bioluminescent images (BLI) produced by the tumors in vivo. This BLI data combined with positronic-emission tomography/computational tomography (PET/CT) analysis using the metabolic marker 2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) is used to monitor changes in tumor metabolism over time. These imaging platforms allow for multiple noninvasive measurements within the tumor/BM microenvironment.

Here we use bioluminescent, X-ray, and positron-emission tomography/computed tomography imaging to study how inhibiting mTOR activity impacts bone marrow-engrafted myeloma tumors in a xenograft model. This allows for physiologically relevant, non-invasive, and multimodal analyses of the anti-myeloma effect of therapies targeting bone marrow-engrafted myeloma tumors in vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

Establecimiento y Análisis de Organoides Tridimensionales (3D) Derivados de los Especímenes de Metastasis ósea del Cáncer de Próstata del Paciente y sus Xenoinjertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Machine Learning Algorithms for Early Detection of Bone Metastases in an Experimental Rat Model

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy exceeding its constituents. This protocol describes the development of an ML algorithm to predict the growth of breast cancer bone macrometastases in a rat model before any abnormalities are observable with standard imaging methods. Such an algorithm can facilitate the detection of early metastatic disease (i.e., micrometastasis) that is regularly missed during staging examinations.
The applied metastasis model is site-specific, meaning that the rats develop metastases exclusively in their right hind leg. The model&#8217;s tumor-take rate is 60%&#8211;80%, with macrometastases becoming visible in magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a subset of animals 30 days after induction, whereas a second subset of animals exhibit no tumor growth.
Starting from image examinations acquired at an earlier time point, this protocol describes the extraction of features that indicate tissue vascularization detected by MRI, glucose metabolism by PET/CT, and the subsequent determination of the most relevant features for the prediction of macrometastatic disease. These features are then fed into a model-averaged neural network (avNNet) to classify the animals into one of two groups: one that will develop metastases and the other that will not develop any tumors. The protocol also describes the calculation of standard diagnostic parameters, such as overall accuracy, sensitivity, specificity, negative/positive predictive values, likelihood ratios, and the development of a receiver operating characteristic. An advantage of the proposed protocol is its flexibility, as it can be easily adapted to train a plethora of different ML algorithms with adjustable combinations of an unlimited number of features. Moreover, it can be used to analyze different problems in oncology, infection, and inflammation.

This protocol was designed to train a machine learning algorithm to use a combination of imaging parameters derived from magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a rat model of breast cancer bone metastases to detect early metastatic disease and predict subsequent progression to macrometastases.

Algoritmos de aprendizaje automático para la detección temprana de metástasis óseas en un modelo experimental de rata

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is essential to understand the process and related mechanisms of prostate cancer bone metastasis for developing new therapeutics. For this, an animal model of bone metastasis is an essential tool. Here, we report detailed procedures to generate a bone metastasis mouse model via intra-cardiac injection of prostate cancer cells. A bioluminescence imaging system can determine whether prostate cancer cells have been accurately injected into the heart and monitor cancer cell metastasis since it has great advantages in monitoring metastatic lesion development. This model replicates the natural development of disseminated cancer cells to form micro-metastases in the bone and imitates the pathological process of prostate cancer bone metastasis. It provides an effective tool for further exploration of the molecular mechanisms and the in vivo therapeutic effects of this disease.

Here, we present a protocol for the intra-cardiac injection of human prostate cancer cells to generate a mouse model with bone metastasis lesions.

Inyección intracardíaca de células de cáncer de próstata humano para crear un modelo de ratón xenoinjerto de metástasis ósea

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

Aislamiento y caracterización del microambiente de la médula ósea en neoplasias mieloides

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Autor destacado: Análisis del microambiente de la médula ósea en neoplasias hematológicas malignas murinas 

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...