Describimos estrategias y protocolos paso a paso para establecer organoides seriales derivados del paciente 3D de cáncer de próstata metastásico óseo. Nuestros protocolos optimizados son prácticos para configurar cultivos 3D para experimentos utilizando material de partida limitado directamente de pacientes o tejidos tumorales de xenoinjerto derivados del paciente. Los organoides 3D de este protocolo se pueden utilizar como modelos ex vivo para comprender los mecanismos básicos de la patología del cáncer de próstata metastásico óseo y para probar el tratamiento.
El medio de cultivo organoide 3D en este protocolo es específico para las células derivadas de la próstata. Otras partes de nuestros protocolos son aplicables a diferentes tipos de tejidos tumorales y sitios metastásicos. La técnica de doming puede resultar ser la parte más difícil de este proceso.
La práctica de la técnica de doming asegurará un tamaño constante de la mezcla abovedada de organoides, medios y Matrigel, y minimizará la formación de burbujas durante la suspensión de la muestra. Demostrar visualmente este método proporciona una mejor comprensión de cómo manejar el Matrigel viscoso para el cultivo con éxito organoides de menor densidad de un bajo número de células. Comience por resuspending el pellet celular en el volumen adecuado de membrana del sótano para una configuración de placa de 24 pozos.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para asegurarse de que las células se resuspenden, luego pipetear el volumen apropiado de la suspensión celular en el centro de una placa de cultivo de tejido precalentó. Invierta la placa e inmediatamente colóquela boca abajo en la incubadora de cultivo celular establecida en 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Pipetear el volumen adecuado de medio precalegado que contenga 10 micromolares Y-27632 dihidrocloruro en cada pozo.
Para formar una cúpula flotante de la cúpula redonda adjunta, separe la cúpula de la placa utilizando un rascador de celda. Corte una pieza de dos por cuatro pulgadas de película de parafina y colóquela encima de los divots de un estante de sujeción de punta vacía de una caja de punta de pipeta de plástico de un mililitro. Utilice un dedo índice enguantado para presionar suavemente hacia abajo en la película de parafina para trazar los divots teniendo cuidado de no romper a través de la película.
Rocíe la película de parafina con 70% de etanol y encienda la lámpara UV en la campana de cultivo celular para esterilizar la película preparada durante al menos 30 minutos. Mientras tanto, resuspender las células preprocesadas en 20 microlitros de membrana del sótano. A continuación, pipetear la suspensión en los divots formados en la película de parafina.
Coloque las perlas solidificadas y la película de parafina en una placa de seis pozos y pipetee de tres a cinco mililitros de medio precalentado que contenga 10 micromolares Y-27632 dihidrocloruro en cada pozo mientras cepilla suavemente las cuentas de la película de parafina. Para procesar los organoides para la histología, retire los medios existentes del pozo teniendo cuidado de no aspirar las cúpulas de membrana del sótano. Añadir un volumen igual de solución de recuperación celular e incubar la placa durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, desalojar la cúpula de membrana del sótano con una pipeta y aplastarla con una punta de pipeta. Recoger la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 veces g en cuatro grados Centígrados durante cinco minutos, luego retire el sobrenadante y dejó a un lado.
Guarde todos los sobrenadantes hasta el paso final cuando se confirme la presencia de organoides en el volumen deseado de PBS frío y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para desalojar mecánicamente el pellet sin interrumpir los organoides. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. Fijar el pellet en un volumen igualado de 4%PFA durante 60 minutos a temperatura ambiente.
Después de la fijación, repita el paso de centrifugación y el lavado PBS. A continuación, agregue lentamente 200 microlitros de 2% de agarosa caliente e inmediatamente, pero suavemente, desenganche el pellet celular de la pared del tubo sin interrumpirlo con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro. Para el método de giro de agarosa hacia abajo, es fundamental separar el pellet celular de la pared del tubo justo después de agregar agarosa usando una aguja de calibre 25.
Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, desprendala del tubo con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro y transfiérelo a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Llene el tubo con 70% de etanol y proceda con el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la incrustación de parafina. Este protocolo se utilizó con éxito para establecer organoides 3D a partir de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de cáncer de próstata metastásico hueso, así como directamente del tejido canceroso.
Los organoides mostraron diferentes fenotipos que se manifestaron como quistes, esferoides y organoides de mayor complejidad. Una cúpula entera de membrana de sótano y organoides se puede ver en una imagen cosida de 25 imágenes de aumento de alta resolución y 10X. Para investigar más a fondo el tejido tumoral, se realizó citoquímica inmunofluorescente en una sección de parafina epintina de cinco micrómetros de espesor de organoides dirigida al marcador celular epitelial basal cytokeratin-5, marcador celular epitelial luminoso cytokera-8 y DAPI.
Este protocolo se puede optimizar para otras aplicaciones como la hinchazón occidental, el cultivo en cocultura y la citometría de flujo para explorar las características de los organoides 3D y los efectos de los tratamientos farmacológicos. Estos experimentos podrían abordar los mecanismos de resistencia a los medicamentos y la eficacia de nuevas terapias solos o en combinación con las terapias actuales. Los organoides 3D de esta técnica conservan la heterogeneidad entre sujetos e intra-sujetos y, por lo tanto, son un modelo más preciso de la enfermedad en pacientes.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren mecanismos de resistencia a los medicamentos, tumorigenesis, metástasis y terapias que pueden ser más predecibles de la progresión de la enfermedad en los pacientes y su respuesta a la terapia.
