Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo del URMC. Este trabajo fue apoyado por el Premio Académico de la Sociedad Americana de Hematología, el Premio de la Fundación para la Investigación de la Leucemia y las subvenciones de los NIH R01DK133131 y R01CA266617 otorgadas a J.B.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de animales de la Universidad de Rochester. Para modelar los SMD de alto riesgo, se emplea el modelo murino NHD1319 disponible en el mercado. En este modelo, se analizan las células estromales de la médula ósea en ratones hembra NHD13 a las 8 semanas de edad, antes de la aparición de la enfermedad. De novo La LMA se genera como se ha descrito anteriormente 6,11,20. Los oncogenes utilizados para inducir LMA, como MLL-AF9 y NRas, se marcan con GFP o YFP, lo que permite el análisis de las poblaciones de médula ósea GFP no leucémicas mediante citometría de flujo. En resumen, los ratones hembra C57BL/6J de 10 semanas de edad se trasplantan con células murinas de LMA GFP/YFP+, y la médula ósea se extrae 2 semanas después del trasplante. Si bien en este estudio se utilizan ratones hembra con fines de demostración, este protocolo se puede realizar con ratones machos o hembras. También se puede llevar a cabo utilizando un fémur o todos los huesos largos.
1. Extracción de médula ósea
NOTA: Para obtener más información sobre el protocolo de disección animal, consulte Amend et al.26.
<ol><li>Limpie el mortero con etanol al 70%, enjuáguelos con tampón FACS frío (Tabla 1) y colóquelos en hielo para que se enfríen antes de comenzar la cosecha. Además, coloque el tampón MAC (Tabla 1) en el banco para permitir que alcance la temperatura ambiente.</li>
	<li>Sacrificar al animal siguiendo las pautas y protocolos institucionales de cuidado y uso de animales.</li>
	<li>En la mesa de trabajo, rocíe bien el ratón con etanol al 70% hasta que su pelaje esté mojado. Con pinzas y tijeras curvas, levante la piel del abdomen y haga dos incisiones de aproximadamente 0,5 mm de longitud a ambos lados del ratón, laterales desde el abdomen. A continuación, realice una incisión de 0,5 mm distal desde el abdomen. Tira hacia abajo para quitar la piel y el pelaje de las patas del ratón.</li>
	<li>Coloque las tijeras perpendiculares a la pelvis, presione hacia abajo mientras tira hacia arriba del fémur con fórceps. La cabeza femoral debe separarse de la pelvis. Separe el fémur y la tibia en la articulación patelofemoral. Coloque los huesos en el tampón FACS en una placa de 6 pocillos sobre hielo.</li>
	<li>Extraiga el tejido de los huesos con tejido de laboratorio y coloque los huesos limpios en una nueva placa de 6 pocillos con tampón FACS fresco en hielo.</li>
	<li>Coloque todos los huesos en el mortero con 2-5 ml de tampón FACS para que todos los huesos queden sumergidos en el tampón (ajuste el volumen de tampón en función de la cantidad de huesos que esté procesando). Triture y muela los huesos con el mortero con movimientos circulares hasta que se libere el tejido de la médula ósea.</li>
	<li>Con una jeringa de 3 ml, homogeneice la médula ósea tirando hacia arriba y hacia abajo del líquido del mortero.</li>
	<li>Con una jeringa de 3 ml, extraiga el líquido del mortero y fíltrelo a través de un colador de células de 70 μm en un tubo de 50 ml con hielo. Enjuague los trozos de hueso/tejido del filtro nuevamente en el mortero con tampón FACS y regrese al paso 1.7 para homogeneizar y colar por segunda vez. Esto constituye la fracción de la médula ósea.</li>
	<li>Enjuague las piezas óseas restantes (espículas) nuevamente en el mortero con tampón FACS y enjuáguelas en un tubo de 15 ml con tampón FACS para garantizar el máximo rendimiento celular. Esta es la fracción de las espículas óseas.</li>
</ol>2. Digestión de la médula ósea
<ol><li>Centrifugar la médula ósea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender la médula ósea en 2 mL de la mezcla de digestión de médula ósea (Tabla 1) y transferirla a un tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min en un rotador.</li>
	<li>Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la digestión enzimática. Filtre la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en un tubo nuevo de 50 ml.</li>
	<li>Diluir la mezcla a 400 x g durante 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo de médula ósea en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (ver Tabla de materiales). Incubar durante 4 minutos en hielo.</li>
	<li>Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la lisis. Filtre la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en un tubo nuevo de 50 ml.</li>
	<li>Diluir la mezcla a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 100 μL de tampón FACS.</li>
</ol>3. Digestión de las espículas óseas
<ol><li>Agita las espículas óseas del paso 1.9 y deja que se asienten. Decantar el sobrenadante y conservar el hueso en la parte inferior.</li>
	<li>Resuspender las espículas óseas en 1 mL de la mezcla de digestión de la espícula ósea (Tabla 1).</li>
	<li>Coloque los tubos en un rotador de tubos durante 60 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la digestión enzimática. Filtrar la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en el tubo de 50 ml que contiene médula ósea lisada y digerida por glóbulos rojos.</li>
</ol>4. Tinción
<ol><li>Mezcle suavemente las espículas óseas y la suspensión de células de la médula ósea.</li>
	<li>Utilizar 10 μL de la suspensión celular para contar el número de células vivas en un hemocitómetro utilizando tinción basada en azul de tripano al 0,4%, como se describe en los protocolos publicados27. Recoja 50.000 células para un control sin tinción de la suspensión celular.</li>
	<li>Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspenderlo en 100 μL de tampón FACS. NOTA: Los anticuerpos se pueden ajustar para determinar la dilución ideal. La selección de anticuerpos (epítopos y fluorocromos) se puede personalizar.</li>
	<li>Para la tinción con anticuerpos para la depleción magnética, agregue FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) y Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con tampón FACS, extraer 50.000 células (~50 μL) para el control teñido con APC, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C y volver a suspender en 100 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Para la tinción de la suspensión celular con microperlas para el agotamiento magnético, agregue mIgG (8 μL por 25 x 106 células) y microperlas anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con 10 ml de tampón FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
</ol>5. Agotamiento de la muestra por clasificación magnética
NOTA: Este paso se lleva a cabo utilizando un separador magnético manual disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este paso también se puede realizar con un separador automatizado (ver Tabla de materiales).
<ol><li>Prepare la columna LD lavándola con 2 mL de tampón MACs (Tabla 1). Deseche el efluente y cambie el tubo de recolección.</li>
	<li>Resuspenda hasta 1 x 108 células en tampón MAC y fíltrelas a través de un tubo de ensayo de 5 ml con una tapa de filtro de células de 35 μm.</li>
	<li>Coloque la columna LD en el soporte del separador magnético. Coloque un tubo de ensayo de 5 ml debajo de la columna para recoger el eluido.</li>
	<li>Agregue la suspensión de celda a la columna LD preparada. Deje que la fracción negativa fluya hacia el tubo de recolección. Lavar la columna dos veces con 1 mL de tampón MACs, recogiendo el eluido en el mismo tubo. Esta es la fracción negativa utilizada en el paso 5.6 a continuación.</li>
	<li>Retire la columna LD del soporte del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de ensayo de 5 ml. Utilice una pipeta para dispensar 3 ml de tampón en la columna para eliminar las células que han sido marcadas positivamente, utilizando el émbolo de columna.</li>
	<li>Centrifugar las fracciones negativa y positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspenderlos en 100 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Contar 10 μL de las fracciones negativa y positiva con azul de tripano al 0,4%. Los volúmenes para el osteoanálisis/tinción del panel endotelial a continuación se basarán en este recuento de células.</li>
	<li>Utilice 50.000 células vivas de la fracción positiva para los controles de compuerta de citometría de flujo.</li>
</ol>6. Osteoanálisis/tinción del panel endotelial
NOTA: La compensación debe realizarse siguiendo los protocolos estándar de citometría de flujo, incluidos todos los controles apropiados de tinción y compuerta.
<ol><li>Para la tinción de la fracción negativa CD45/Ter119 (1 μl de cada anticuerpo por 1 x 106 células), agregue CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE y CD140a-PE-Cy5 (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con 2 ml de tampón FACS, luego centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón FACS y una dilución 1:1000 de PI para tinción viva/muerta, luego filtre la muestra a través de un tubo de ensayo de 5 ml con una tapa de filtro celular de 35 μm.</li>
	<li>Analice las celdas en un citómetro de flujo multicolor.</li>
</ol>

Aislamiento y caracterización del microambiente de la médula ósea en neoplasias mieloides

<ol>
	<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li><li>Pinho, S., Frenette, P. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia.">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li><li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression.">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).</li><li>Sekeres, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> JoVE. 110, e53936 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> , (2023).</li><li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+acute+myeloid+leukemia+progression+and+drug+response.">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response.</a> Blood. 128 (22), 2662 (2016).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Baccin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+the+molecular,+cellular+and+spatial+bone+marrow+niche+organization.">Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization.</a> Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).</li><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. 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No se declaran conflictos de intereses.

Los modelos de leucemia murina se han utilizado ampliamente para identificar señales intrínsecas y de nicho celular que promueven la progresión agresiva de la leucemia mieloide 6,19,21. Aquí, se presenta un protocolo integral basado en citometría de flujo para definir la composición celular del microambiente de la médula ósea en modelos murinos de SMD y LMA.
Antes de adquirir datos de citometr...

El microambiente de la médula ósea está formado por células hematopoyéticas, células estromales no hematopoyéticas y la matriz extracelular 1,2. Este microambiente puede promover la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas, regular la diferenciación del linaje y proporcionar soporte estructural y mecánico al tejido óseo 1,2,3,4,5. El nicho estromal incluye células osteolinajes, fibroblastos, células nerviosas y células endoteliales6, mientras que el nicho hematopoyético está formado por las poblaciones linfoides y mieloides 1,2,3. Además de apoyar las CMH normales, el microambiente de la médula ósea también puede desempeñar un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los SMD y la LMA 7,8,9,10,11. Se ha demostrado que las mutaciones en las células del linaje osteológico promueven el desarrollo de SMD, LMA y otras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.
Los síndromes mielodisplásicos son un grupo de trastornos preleucémicos que surgen de mutaciones en las células madre hematopoyéticas. El SMD se asocia con frecuencia con un bloqueo en la diferenciación de las HSC y la producción de células displásicas, lo que a menudo puede conducir a insuficiencia de la médula ósea. El SMD es la neoplasia mieloide más comúnmente diagnosticada en los Estados Unidos y se asocia con una tasa de supervivencia a 3 años del 35% al 45%15. Los SMD a menudo se asocian con un alto riesgo de transformación a leucemia mieloide aguda. Esto puede ser una complicación mortal, ya que la LMA derivada de SMD es resistente a la mayoría de las terapias y es probable que recaiga. La LMA que surge de novo debido a translocaciones o mutaciones en el tallo hematopoyético y los progenitores también suele ser resistente a la quimioterapia estándar16,17. Dado que los SMD y la LMA son principalmente enfermedades de los ancianos, y la mayoría se diagnostican después de los 60 años, la mayoría de los pacientes no son elegibles para trasplantes curativos de médula ósea. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Dado que el microambiente de la médula ósea puede proporcionar apoyo a las células malignas14, la definición de los cambios en el nicho de la médula ósea con la progresión de la enfermedad puede conducir a la identificación de nuevas terapias destinadas a inhibir la remodelación del nicho tumoral. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Con este fin, es fundamental identificar y caracterizar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea que pueden proporcionar apoyo a las células malignas.
Se han generado varios modelos murinos de LMA y SMD que pueden utilizarse para estudiar los cambios en el microambiente de la médula ósea durante el inicio y la progresión de la enfermedad 6,1,19,20,21,22. En este trabajo se describen los protocolos para identificar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea utilizando modelos murinos de LMA inducida por retrovirales 6,20, así como el modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible comercialmente de transformación de SMD de alto riesgo a LMA19. Los ratones trasplantados con células de LMA de novo sucumben a la enfermedad en 20-30 días6. Los ratones NHD13 desarrollan citopenias y displasia de médula ósea alrededor de las 15-20 semanas, que finalmente se transforma en LMA, y casi el 75% de los ratones sucumben a la enfermedad alrededor de las 32 semanas. Para analizar las poblaciones de microambiente de médula ósea modelo murino, se recolectan huesos, se digieren médula ósea y espículas óseas mediante digestión enzimática, y luego se enriquecen las células para poblaciones no hematopoyéticas CD45-/Ter119- mediante clasificación magnética. Si bien se han descrito previamente análisis similares 11,13,22,23,24,25, a menudo se centran en la médula ósea o en el hueso y no incorporan células de ambas fuentes en sus análisis. La caracterización combinada de estas poblaciones, junto con los análisis de expresión génica, puede proporcionar una comprensión completa de cómo el microambiente hematopoyético celular proporciona apoyo para el inicio y la progresión de la enfermedad (Figura 1). Si bien el protocolo que se describe a continuación se centra en el modelo de LMA inducida por retrovirales y en un modelo genético de SMD, estas estrategias se pueden adaptar fácilmente para estudiar los cambios en el nicho de la médula ósea de cualquier modelo murino de interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

El microambiente de la médula ósea está formado por distintas poblaciones celulares, como las células estromales mesenquimales, las células endoteliales, las células del linaje osteológico y los fibroblastos, que proporcionan soporte a las células madre hematopoyéticas (CMH). Además de apoyar las HSC normales, el microambiente de la médula ósea también desempeña un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los síndromes mielodisplásicos (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA). Las mutaciones asociadas a los SMD en las CMH conducen a un bloqueo en la diferenciación y a una insuficiencia progresiva de la médula ósea, especialmente en los ancianos. A menudo, los SMD pueden progresar a LMA resistente a la terapia, una enfermedad caracterizada por una rápida acumulación de blastocitos mieloides inmaduros. Se sabe que el microambiente de la médula ósea está alterado en pacientes con estas neoplasias mieloides. En este trabajo se describe un protocolo completo para aislar y caracterizar fenotípicamente células microambientales de la médula ósea a partir de modelos murinos de síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda. Aislar y caracterizar los cambios en las poblaciones del nicho de la médula ósea puede ayudar a determinar su papel en el inicio y la progresión de la enfermedad y puede conducir al desarrollo de nuevas terapias dirigidas a las alteraciones promotoras del cáncer en las poblaciones del estroma de la médula ósea.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

Autor destacado: Análisis del microambiente de la médula ósea en neoplasias hematológicas malignas murinas 

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

En este artículo se describe un método basado en citometría de flujo para analizar poblaciones microambientales de médula ósea, como las células endoteliales y mesenquimales, a partir de modelos murinos de SMD y leucemia (Figura 1). La Figura 2 muestra la estrategia de compuerta para la detección de poblaciones de interés, comenzando con la selección de células (P1) en la fracción digerida y agotada en CD45/Ter119 a través del perfil de dispersión f...

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Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Nuestra investigación tiene como objetivo explorar cómo el entorno cambiante de la médula ósea influye en el crecimiento tumoral. Desarrollamos un protocolo de citometría de flujo para analizar las células no inmunes en médula ósea y tejidos óseos, centrándonos en las neoplasias hematológicas malignas murinas. Este método es adaptable para el estudio de la médula ósea en varios modelos murinos.Nuestro estudio se centra en aislar e identificar alteraciones en las poblaciones estromales de la médula ósea durante la progresión del cáncer. Comprender su impacto en la aparición y el avance de la enfermedad podría allanar el camino para nuevos tratamientos que se dirijan a estos cambios que facilitan el cáncer en las células estromales de la médula ósea. Nuestro protocolo combina de manera única digestiones mecánicas y enzimáticas, depleciones magnéticas y citometría de flujo para delinear la composición celular del microambiente de la médula ósea.Destaca por emplear la separación magnética e incorporar células tanto de hueso como de médula, ofreciendo una representación más completa de este microambiente.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

798 vistas.  University of Rochester Medical Center. Nuestra investigación tiene como objetivo explorar cómo el entorno cambiante de la médula ósea influye en el crecimiento tumoral. Desarrollamos un protocolo de citometría de flujo para analizar las células no inmunes en médula ósea y tejidos óseos, centrándonos en las neoplasias hematológicas malignas murinas. Este método es adaptable para el estudio de la médula ósea en varios modelos murinos.Nuestro estudio se centra en aislar e identificar alteraciones en las poblacion...

Video: Autor destacado: Análisis del microambiente de la médula ósea en neoplasias hematológicas malignas murinas 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

Recolección y aislamiento de médula ósea murina para la caracterización del microambiente de la leucemia mieloide 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.