Caracterizar las propiedades de transporte de las terapias y sus portadores es fundamental para garantizar respuestas biológicas eficaces. Estos métodos ayudan en el diseño de portadores de medicamentos cargados de forma óptima para apuntar a los tejidos cargados negativamente. La principal ventaja de estas técnicas es su capacidad para predecir mejor las eficacias terapéuticas in vivo a través de una serie de experimentos in vitro que caracterizan el transporte de soluto a través del tejido.
Las enfermedades del cartílago, como la osteoartritis, no se tratan debido a la incapacidad de los fármacos para penetrar en la matriz de cartílago avascular denso, que requieren portadores de fármacos para prólogo de eficacia terapéutica. Comience usando una delicada toallita de tarea para eliminar suavemente el exceso de PBS de las superficies de tres milímetros de diámetro, explantas de cartílago de un milímetro de espesor. Utilice un equilibrio para registrar rápidamente el peso húmedo de cada explant e inmediatamente coloque los explantes en un baño PBS para evitar la deshidratación.
A continuación, agregue 300 microlitros de solución portadora de péptidos catiónicos recién preparada y 30 micromolares etiquetadas fluorescentemente por pozo a los pozos interiores de una placa de 96 pozos y utilice una espátula para añadir un explan a cada pozo de solución. Llene cada uno de los pozos circundantes con 300 microlitros de PBS y cubra la placa con una tapa. Selle los bordes de la placa con película flexible para minimizar la evaporación y coloque la placa en una coctelera en una incubadora de 37 grados Celsius durante 24 horas a 50 revoluciones por minuto, con una órbita de 15 milímetros.
Al final de la incubación, transfiera el baño de equilibrio de cada pozo a tubos de polipropileno individuales y realice diluciones en serie a partir de la solución portadora de péptidos catiónicos micromolares para generar una curva estándar. A continuación, transfiera 200 microlitros de cada solución y de serie a pozos individuales de una placa negra de 96 pocillos y obtenga lecturas de fluorescencia de cada muestra y estándar en función de las longitudes de onda de excitación y emisión de la etiqueta fluorescente. Para determinar la profundidad de la penetración del portador de péptidos catiónicos dentro de un explant de cartílago, utilice un bisturí para cortar un cartílago de seis milímetros de diámetro, un milímetro de espesor explana por la mitad e hidratar las piezas de medio disco resultantes con inhibidor de proteo complementado PBS.
Aplique epoxi en el centro de un pozo de una cámara de transporte unidimensional diseñada a medida y asegure una explant de medio disco dentro del pozo con el lado superficial del explant mirando hacia arriba el lado ascendente de la cámara. Retire cualquier exceso de pegamento del pozo para evitar el contacto con la superficie de difusión del cartílago y agregue 80 microlitros de inhibidor de la proteasa suplementados con PBS a ambos lados del explant. Pipetear el líquido hacia arriba y hacia abajo en un lado del explant para comprobar si hay fugas en el otro lado.
Si no hay fugas, sustituya el inhibidor de la proteasa suplementado PBS desde el lado ascendente por 80 microlitros de 30 fluorescencia micromolares etiquetada solución portadora de péptido catiónico y coloque cuidadosamente la cámara de transporte en una placa de cultivo celular. Cubra la base del plato con PBS para evitar la evaporación de la solución portadora de péptidos catiónicos. Teniendo cuidado de que no haya contacto directo entre las soluciones de las cámaras aguas arriba y aguas abajo.
Coloque el plato cubierto en una coctelera para limitar la sedimentación de partículas durante cuatro o 24 horas a temperatura ambiente y 50 revoluciones por minuto, con una órbita de 15 milímetros. Al final de la incubación, retire los explantes de la cámara y corte aproximadamente 100 micras de espesor del centro de cada explant. Coloque cada rebanada de explant entre un portaobjetos de vidrio y un resbalón de cubierta e hidrate las rodajas con un inhibidor de la proteasa fresca suplementado con PBS.
Fije la diapositiva en el escenario de un microscopio confocal y obtenga una pila Z de imágenes fluorescentes a través del espesor completo de la rebanada a un aumento de 10X. Abra el archivo de imagen y la imagen J, haga clic en Imagen y seleccione Pilas y Proyecto Z en el menú desplegable. A continuación, introduzca los números de sector de uno a la parte final y, en Tipo de proyección, seleccione Intensidad media y haga clic en Aceptar.
Para evaluar la tasa de difusión del cartílago portador de péptidos catiónicos sin equilibrio, ensamble cada mitad de la cámara de transporte, para incluir una junta de caucho grande, una plaquita de polimetilmetacrilato y una pequeña junta de caucho. Mida el espesor de un explano de cartílago, luego coloque el explant en los pozos de la plaquita de plástico con la superficie superficial mirando a la cámara aguas arriba y empareje las dos mitades juntas para completar el ensamblaje. Utilice una llave para atornillar firmemente las mitades antes de llenar la cámara aguas arriba con dos mililitros de inhibidor de la proteasa suplementado PBS.
Compruebe si hay fugas en la cámara aguas abajo de la cámara aguas arriba. Si no se detecta ninguna fuga, llene la cámara aguas abajo con dos mililitros de PBS suplementado con inhibidor de la proteasa. Agregue una sola mini barra de agitación a las cámaras hacia arriba y aguas abajo y coloque la cámara en una placa de agitación con la cámara alineada de tal manera que el láser del espectrofotómetro se enfoque hacia el centro de la cámara descendente.
Con la parte del receptor de señal del espectrofotómetro detrás de la cámara descendente, recoja lecturas estables de emisión de fluorescencia aguas abajo en tiempo real durante al menos cinco minutos. Después de obtener una lectura estable, agregue un volumen precalculado de solución de material portador de péptidos catiónicos con etiqueta fluorescente a la cámara aguas arriba a una concentración final de baño de tres micromolares, y monitoree la señal fluorescente aguas abajo mientras permite que el transporte de soluto alcance un aumento constante en la pendiente. Una vez que se ha alcanzado un estado estable, transfiera 20 microlitros de solución de la cámara aguas arriba a la cámara aguas abajo para una prueba de pico y recoja las lecturas de fluorescencia aguas abajo en tiempo real.
Una carga positiva demasiado alta limitará la penetración del soluto a la zona superficial, ya que el portador se une demasiado fuerte a los grupos agregcanos cargados negativamente de la matriz del cartílago. Por el contrario, los portadores que son capaces de aprovecharse de las interacciones de carga débiles y reversibles penetran a través de la zona profunda del tejido. Un portador de fármacos cargado de manera óptima, sin embargo, no sólo penetraría en las zonas profundas del tejido, sino que también demostraría una alta absorción de tejido intra, que se puede determinar utilizando las mediciones de fluorescencia del baño de equilibrio y el peso húmedo del tejido, como se muestra.
Los experimentos de transporte de difusión sin equilibrio dan como resultado una curva generada por los datos con una pendiente que aumenta gradualmente. La parte inicial de la curva representa la difusión del soluto a través del cartílago a medida que se producen interacciones de unión a la matriz de soluto. Una vez que los solutos llegan a la cámara aguas abajo, la pendiente de la curva aumenta a medida que las lecturas de fluorescencia aumentan con el tiempo.
Esta segunda parte de la curva alcanza entonces una pendiente constante, que representa la difusión de estado constante. La intercepción X de una línea tangencial dibujada en la parte de estado estacionario de la curva indica el tiempo que se tarda en alcanzar la difusión de estado estable o el retraso tau. Después de la transferencia de la solución desde la cámara aguas arriba a la cámara aguas abajo, se observa un pico de fluorescencia, momento en el que se puede utilizar la intensidad de fluorescencia estabilizada para correlacionar la fluorescencia con la concentración.
A continuación, se pueden calcular los valores representativos de difusión efectiva y de difusión en estado estacionario, como se indica. Tenga en cuenta que la difusividad del estado estacionario es dos órdenes de magnitud superiores a la difusividad efectiva como resultado de todos los sitios de enlace basados en cargos que se están ocupando. Por lo tanto, en este punto, la difusión se basa en el tamaño y no en la carga, lo que resulta en valores de difusión de estado estable similares entre los CPC del mismo tamaño.
Mantener la hidratación del explant y minimizar la evaporación de la solución a lo largo del experimento para evitar cambios en la morfología del cartílago y la concentración de la solución, respectivamente, y para asegurar la adquisición de datos precisos y reproducibles. Siguiendo el diseño de un portador de fármacos cargado de manera óptima, se pueden utilizar varias técnicas de conjugación para modificar los fármacos para mejorar la focalización tisular y facilitar la evaluación de su eficacia biológica.
