Este método describe la ruta completa del diseño, montaje y caracterización de micelas complejas de polielectrolito que son nanopartículas que se forman a partir del autoensamble de polímeros cargados de forma opuesta. Algunos desafíos importantes con el autoensambleo de polielectrolito son evitar las trampas cinéticas y caracterizar las nanopartículas. La técnica de recocido de sal que describimos permite el montaje repetible de micelas con baja dispersión tanto en tamaño como en forma y describimos métodos de caracterización que incluyen dispersión de luz, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y microscopía electrónica.
La entrega de ácidos nucleicos terapéuticos es un desafío de larga data para la nanomedicina. Estas micelas complejas de polielectrolito aprovechan la fuerte carga negativa del ácido nucleico para secuestrarlas en el núcleo de la micela donde la corona de polímero neutro las protege de las nucleas y la respuesta inmune. El método de montaje debe aplicarse a cualquier tipo de polímeros cargados.
Los hemos probado con varios polianiones y policaciones y el método de caracterización debe ser aplicable a cualquier nanopartícula automontada, incluidas las nanopartículas surfactantes y otros sistemas impulsados hidrofóbicamente. Comience incubando la solución de oligonucleótidos a 70 grados celsius durante cinco minutos. Después de la incubación, enfríe durante 15 minutos a temperatura ambiente para recocido térmicamente los ácidos nucleicos, luego agregue 40 microlitros de 20 copolímeros de concentración cargados de mililitro.
Vórtice la solución inmediatamente e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para realizar la recocido de sal, añada solución de cloruro sódico a la solución de oligonucleótidos para una concentración final de un molar y vórtice durante 10 segundos a la velocidad máxima. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego proceder a cargarla en el cartucho de diálisis.
Antes de la carga, etiquete los cartuchos con marcador permanente y remojelos en tampón durante al menos dos minutos para hidratar las membranas. Retire la tapa girando en sentido antihorario y cargue la muestra con una punta de pipeta de carga de gel. Apriete suavemente la membrana para eliminar el exceso de aire y reemplace la tapa.
Coloque los cartuchos en 1X PBS 0.5 baño de diálisis de cloruro sódico molar asegurándose de que están flotando con ambas membranas expuestas al baño. Después de 24 horas, transfiera los cartuchos a 1X PBS y remoje durante 24 horas adicionales. Después de la diálisis final, recupere la muestra retirando los cartuchos del baño, quitando la tapa y retirando la muestra con una punta de pipeta de carga de gel.
Coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros limpio y refrigídala hasta que esté lista para su uso. Prepare la muestra en el instrumento DLS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y, a continuación, adquiera datos durante al menos un minuto asegurándose de que la tasa de recuento es constante durante todo el tiempo de adquisición. Examine los datos de autocorrelación.
La línea base de largo tiempo debe ser plana y la curva de autocorrelación debe ser suave con una dispersión mínima. El ruido en los datos se puede mejorar mediante la adquisición de más datos. Para realizar la reducción y el análisis de datos con Irena, comience importando micelle en conjuntos de datos en segundo plano.
Trazar la muestra y el fondo juntos en una escala de registro-log y calcular la proporción de muestra a fondo y verificar la asintota Q alta. Calcular la relación media en este rango Q y utilizar la macro de manipulación de datos para escalar el fondo con la relación calculada. A continuación, trace la señal restada en segundo plano sobre Q y guarde los datos con un nuevo nombre asegurándose de no sobrescribir los datos originales.
Abra la macro de modelado y, a continuación, cargue y trace los datos restados en segundo plano. Para encontrar un modelo aproximado para la superficie externa de la micela compleja de polielectrolito, o PCM, seleccione el flujo al rango Q moderado en los controles de datos asegurándose de incluir oscilaciones si están presentes. En los controles de modelo, seleccione la primera población de dispersión y asegúrese de que es la única en uso.
Seleccione la distribución de tamaño para el modelo, elija el tipo de distribución deseado y seleccione el factor de forma. Este ejemplo es para un cilindro flexible que debe agregarse manualmente bajo el factor de forma del usuario. Descargue y agregue el factor de forma de cilindro flexible, luego ingrese los nombres de función y los valores iniciales para los parámetros uno y dos que corresponden a la longitud del cilindro y la longitud de Kuhn respectivamente.
Estos cilindros son más largos de lo que puede resolver SAXS, por lo que el parámetro de longitud del cilindro se fija en un valor grande. Establezca los parámetros iniciales para la búsqueda introduciendo valores en los campos de escala, tamaño medio y ancho. A continuación, haga clic en Calcular modelo para dibujar el factor de forma resultante.
Una vez encontrados los parámetros razonables, haga clic en ajustar el modelo para realizar un mínimo de cuadrados no lineales que se ajuste a los datos. A continuación, modele la dispersión de los polímeros individuales dentro del núcleo PCM. Ajuste los controles de datos para seleccionar el rango Q donde se produce un exceso de dispersión que suele estar en el rango moderado a alto.
Agregue una segunda población de dispersión y asegúrese de que es la única en uso. Seleccione un nivel unificado para el modelo, ajuste los factores GDA G y RG para asegurarse de que el modelo no prediga la dispersión excesiva a baja Q y utilice el PB de ajuste entre la macro de cursores para obtener una conjetura inicial para estos parámetros. En cuanto al factor de forma, realice un ajuste no lineal para el modelo de nivel unificado.
Si hay un pico de difracción, agregue un tercer modelo para el pico de difracción en el rango Q de interés. Una vez que se obtengan valores de ajuste aproximados para las poblaciones de dispersión individuales, active los tres juntos y optimice el ajuste combinado. Por último, compruebe que cada valor permanece físicamente razonable y guarde el ajuste seleccionando Almacenar en carpeta.
El resultado de este procedimiento debe ser un modelo compuesto que describa los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño en un amplio rango de escalas de tamaño. Este protocolo se utilizó para diseñar, ensamblar y caracterizar micelas complejas de polielectrolito de ácido nucleico o PCMs.
Los datos dinámicos de dispersión de luz se adquirieron para PCM esféricos formados a partir de copolímeros de bloque relativamente largos en oligonucleótidos cortos de una sola cadena. La función de autocorrelación se descomisó a un valor plano con la escala de tiempo única, lo que da como resultado el pico de tamaño único en la distribución de tamaño de repIS. La dispersión compleja de rayos X de pequeño ángel o los espectros de intensidad SAXS se pueden ajustar con precisión combinando modelos para las múltiples correlaciones espaciales que están presentes y la dispersión de luz multiángulo se puede utilizar para extender las mediciones de dispersión a escalas de longitud más largas.
Los MDM de morfología variable también se pueden tomar imágenes con microscopía electrónica para verificar que los radios y la forma del núcleo son consistentes con los valores obtenidos a partir de la adaptación de los datos SAXS. Al ajustar los datos de SAXS, es importante tener en cuenta cada función de dispersión y utilizar métodos complementarios como TEM para asegurarse de que está utilizando el factor de forma correcto.
