Dada la amplia gama de secuencias de péptidos cortos, este método se puede extender a muchos otros diseños de nanopartículas. La modificación del péptido puede hacer que el sistema sea adecuado para fines de diagnóstico. Encapsular el platino anticascológico en medicamentos con agente estabilizador biodegradable de baja toxicidad es muy relevante para aplicaciones farmacéuticas.
Los estudios preliminares en vivo con cáncer de ovario son prometedores y se investigarán más a fondo. Para empezar, suspende 50 miligramos de cisplatino en cuatro mililitros de agua ultrapura a 60 grados centígrados. Agregue la solución de nitrato de plata a la solución de cisplatino y revuelva la mezcla a 300 a 400 RPM durante dos horas a 60 grados centígrados en la oscuridad.
Después de eso, utilice 10%en peso ácido clorhídrico para confirmar que no hay iones de plata libres en la solución. Si no se forma cloruro de plata adicional al agregar ácido clorhídrico, centrifugar la mezcla a 3, 220 veces la gravedad durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros.
A continuación, pruebe el filtrado en busca de platino aplicando de dos a tres gotas a 10 dos cristales de cloruro. El platino está presente si la suspensión se vuelve marrón oscuro o naranja. A continuación, añadir 13,3 miligramos de hidróxido de sodio en un mililitro de agua en 94,2 miligramos de suspensión de ácido oleico en tres mililitros de agua a 60 grados centígrados.
Revuelva la mezcla durante dos horas a 60 grados centígrados. Luego, apague el fuego y continúe revolviendo a temperatura ambiente durante 16 a 24 horas para obtener el producto crudo como un precipitante aceitoso, de color amarillo-marrón. Centrifugar la mezcla de reacción a 3, 220 veces la gravedad durante 10 minutos, y retire el sobrenadante.
Seque los productos en un evaporador rotatorio a 25 grados centígrados. Suspenda el producto crudo en cinco mililitros de acetonitrilo mediante vórtice y recuperando el producto por centrifugación. Repita este proceso de lavado al menos dos tres veces más para obtener el conjugado puro de ácido oleico platino II como un sólido amarillo pálido.
En primer lugar, remojar 5,7 gramos de L-fenilalanina protegida Fmoc funcionalizada resina Wang en 25 mililitros de dimetilformamida durante una hora. Luego, remoje la resina en 15 mililitros de 20%piperidina en DMF durante cinco minutos mientras agita a 80 RPM para des-proteger la amina. Escurrir la resina y repetir la desprotección durante 20 minutos.
Lavar la resina con DMF y alcohol isopropílico después. Una vez confirmada la desprotección, añadir la L-tirosina protegida por Fmoc TBTU y DIPEA y agitar la mezcla durante 16 a 24 horas para realizar el acoplamiento. Lave la resina con DMF y alcohol isopropílico.
Realice la prueba de Kaiser y continúe con la desprotección y lave como se describió anteriormente. Pareja y desprotege la lisina protegida Fmoc de la misma manera. Lave la resina con DMF, IPA, metanol, diclorometano y éter dietílico después.
Deje a un lado un gramo de resina con rodamientos KYF para modificar FITC. Remoje la resina restante en 95%ácido trifluoroacético. 2.5%triisopropylsilane y 2.5% agua durante tres horas para cortar el tripéptido de la resina.
Precipitar el péptido crudo con éter dietílico enfriado a 20 grados Celsius. Lavar el precipitado tres veces por centrifugación en porciones de 30 a 40 mililitros de éter dietílico frío y secarlo al vacío. A continuación, mezclar el gramo restante de resina KYF con 120,1 miligramos de ácido 6-acetohexanoico en 30 mililitros de DMF con TBTU y DIPEA.
Agitar la mezcla durante 16 a 24 horas a temperatura ambiente para obtener el tripéptido modificado de axida. A continuación, combinar 253 miligramos de esta resina con 3,78 miligramos de cobre sólido (I)yoduro 71,9 miligramos de propargyl florisean y 2,24 miligramos de DIPEA. Deje que la mezcla reaccione mientras agita durante 24 horas.
A continuación, lave a fondo la resina de cojinete KYF modificada de FITC. Corte el KYF modificado FITC de la resina y purifique de la misma manera que el tripéptido no modificado. Para comenzar a preparar la nanoemoulsión, disolver 10 miligramos del ácido oleico platino II conjugado en 1,5 mililitros de IPA.
Dibuje esta solución en una jeringa de 5 mililitros, coloque una aguja de calibre 20 y monte la jeringa en una bomba de jeringa sobre el área de reacción. Ajuste la bomba de la jeringa a 0,1 mililitros por minuto. Para una nanoemulsión con KYF modificado por FITC, disuelva un miligramo de KYF modificado por FITC y un miligramo de KYF sin modificar en 20 mililitros de agua.
Para una nanoemulsión con KYF no modificado, disolver en su lugar dos miligramos de KYF en 20 mililitros de agua. Caliente la solución KYF modificada o sin modificar de FITC a 37 grados centígrados. Asegúrese de que la solución KYF esté agitando a unas 400 RPM y de que la jeringa esté alineada con la solución.
A continuación, inicie la bomba de la jeringa para comenzar a añadir el ácido oleico platino dos gotas conjugadas sabias. Una vez añadido el conjugado, reduzca la velocidad de agitación a 150 RPM y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Continúe revolviéndolo durante 16 a 24 horas.
A continuación, concentre el nanoemultiión en una unidad de filtro centrífugo de 10.000 Daltons. Lave la nanoemulsión en una unidad de filtro centrífuga tres veces con cuatro porciones de mililitro de agua ultrapura. Y luego almacenarlo como una solución acuosa a cuatro grados Centígrados.
El producto final es opalescente para nanopartículas KYF y fluorescentes para nanopartículas modificadas por FITC. Las gotas en una nanoemulsión preparada con KYF no modificado eran esféricas, bien dispersas y de tamaño relativamente uniforme. Basados en imágenes de microscopía electrónica de transmisión, los núcleos tenían unos 107 nanómetros de diámetro.
La nanoemulsión modificada por FITC, que aparece aquí en verde, podría entrar en células de varias líneas celulares de cáncer de ovario. Mientras que el diámetro hidrodinámico de ambas formulaciones aumentó durante cuatro meses de almacenamiento en agua, las dimensiones totales se conservaron. Además, no se observó ninguna opsonización de la emulsión después de un día de incubación en un 20% de suero bovino fetal.
La liberación de platino de la emulsión fue más lenta a pH 7,4 con sólo el 20,8% del platino liberado después de cuatro horas. La liberación de platino se aceleró a medida que el pH disminuía. La nanoemulsión recubierta de KYF con platino redujo la viabilidad de estas líneas celulares de cáncer de ovario en un grado mucho mayor de lo que se logró con la carboplatina, el análogo clínicamente relevante.
La nanoemulsión también mostró una reducción comparable o mayor en la viabilidad que el cisplatino en cinco de las seis líneas celulares. La nanoemulsión recubierta con KYF indujo consistentemente una reducción comparable o mayor en la viabilidad que el ácido oleico platino II conjugado solo. Este es un método simple y eficiente para encapsular terapias hidrofóbicas dentro del andamio de nanopartículas de base de tripéptidos.
Los péptidos cortos son biodegradables y tienen baja toxicidad, lo que es significativo para la medicina y la biotecnología. Realice este procedimiento bajo la campana de humos para evitar la exposición a disolventes orgánicos. El ácido oleico platino y las nanoemulsiones de platino KYF tienen propiedades contra el cáncer y, por lo tanto, deben manejarse con especial cuidado.
Este método es simple en términos de baja actividad de filabilator y equipos, sin embargo se basa en la correcta aplicación de la estrategia de síntesis, y los conceptos químicos subyacentes. Nuestro método se puede extender para entregar otras moléculas de fármacos pequeños. El núcleo de nanopartículas consiste en ácido oleico y por lo tanto es adecuado para la encapsulación de agentes hidrófobos.
