Die Charakterisierung der Transporteigenschaften von Therapeutika und deren Trägern ist entscheidend für die Gewährleistung wirksamer biologischer Reaktionen. Diese Methoden helfen bei der Entwicklung optimal geladener Arzneimittelträger für die Ausrichtung negativ geladener Gewebe. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist ihre Fähigkeit, therapeutische Effizienzen in vivo durch eine Reihe von In-vitro-Experimenten besser vorherzusagen, die den soluten Transport durch Gewebe charakterisieren.
Knorpelerkrankungen wie Arthrose bleiben unbehandelt, da Medikamente nicht in der Lage sind, in die dichte avaskuläre Knorpelmatrix einzudringen, was die Arzneimittelträger zur therapeutischen Wirksamkeit des Prologs verpflichtet. Beginnen Sie mit einem filigranen Aufgabenwisch, um überschüssige PBS von den Oberflächen mit drei Millimetern Durchmesser, einem Millimeter dicken Knorpelexplanten, sanft zu entfernen. Verwenden Sie ein Gleichgewicht, um schnell das Nassgewicht jeder Explantation aufzuzeichnen und legen Sie die Expflanzen sofort in ein PBS-Bad, um Austrocknung zu verhindern.
Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter frisch zubereitete, 30 mikromolare fluoreszierend markierte kationische Peptidträgerlösung pro Brunnen in die inneren Brunnen einer 96-Well-Platte und verwenden Sie einen Spachtel, um jedem Bohrgut der Lösung ein Explant hinzuzufügen. Füllen Sie jede der umliegenden Brunnen mit 300 Mikroliter PBS und bedecken Sie die Platte mit einem Deckel. Versiegeln Sie die Kanten der Platte mit einem flexiblen Film, um die Verdunstung zu minimieren, und legen Sie die Platte auf einen Shaker in einem 37 Grad Celsius Inkubator für 24 Stunden bei 50 Umdrehungen pro Minute, mit einer Umlaufbahn von 15 Millimetern.
Am Ende der Inkubation das Gleichgewichtsbad von jedem Brunnen in einzelne Polypropylenrohre übertragen und serielle Verdünnungen aus der 30 mikromolaren kationischen Peptidträgerlösung 30 vornehmen, um eine Standardkurve zu erzeugen. Übertragen Sie dann 200 Mikroliter jeder Lösung und normieren Sie in einzelne Brunnen einer schwarzen 96-Well-Platte und erhalten Fluoreszenzwerte jeder Probe und Norm basierend auf den Anregungs- und Emissionswellenlängen des Fluoreszenzetiketts. Um die Tiefe der kationischen Peptidträgerpenetration innerhalb eines Knorpelexplantationes zu bestimmen, verwenden Sie ein Skalpell, um sechs Millimeter Durchmesser zu schneiden, einen Millimeter dicken Knorpelexplante in der Hälfte und hydratisieren Sie die resultierenden Halbscheibenstücke mit Proteus-Inhibitor ergänzt PBS.
Tragen Sie Epoxid auf die Mitte eines Brunnens einer kundenspezifischen eindimensionalen Transportkammer auf und sichern Sie eine Halbscheibenexplantation innerhalb des Brunnens mit der oberflächlichen Seite der Explantation, die auf die vorgelagerte Seite der Kammer gerichtet ist. Entfernen Sie überschüssigen Kleber aus dem Brunnen, um den Kontakt mit der Diffusionsoberfläche des Knorpels zu verhindern, und fügen Sie 80 Mikroliter Protease-Inhibitor ergänzt PBS auf beiden Seiten der Explantation hinzu. Pipette die Flüssigkeit auf und ab auf einer Seite der Explant, um auf Leckage auf der anderen Seite zu überprüfen.
Wenn keine Leckage vorhanden ist, ersetzen Sie den protease-Inhibitor ergänztE PBS von der vorgelagerten Seite durch 80 Mikroliter 30 Mikromollarfluoreszenz markiert kationic Peptid Trägerlösung und legen Sie die Transportkammer sorgfältig in eine Zellkulturschale. Bedecken Sie die Basis der Schale mit PBS, um eine verdampfende verdampfende kationische Peptidträgerlösung zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass es keinen direkten Kontakt zwischen den Lösungen aus den vor- und nachgelagerten Kammern gibt.
Legen Sie die abgedeckte Schale auf einen Shaker, um die Partikelsedimentation für vier oder 24 Stunden bei Raumtemperatur und 50 Umdrehungen pro Minute mit einer Umlaufbahn von 15 Millimetern zu begrenzen. Am Ende der Inkubation entfernen Sie die Expflanzen aus der Kammer und schneiden Sie etwa 100 Mikrometer dicke Scheiben aus der Mitte jeder Explantation. Legen Sie jede Scheibe Explantation zwischen eine Glasrutsche und einen Deckelschlupf und hydratisieren Sie die Scheiben mit frischem Protease-Inhibitor ergänzt PBS.
Fixieren Sie die Folie auf der Bühne eines konfokalen Mikroskops und erhalten Sie einen Z-Stack mit fluoreszierenden Bildern durch die volle Dicke der Scheibe bei 10-facher Vergrößerung. Öffnen Sie die Bilddatei und das Bild J, klicken Sie auf Bild, und wählen Sie im Dropdown-Menü Stapel und Z-Projekt aus. Geben Sie dann die Slice-Zahlen von einem bis zum endgültigen Slice ein, und wählen Sie unter Projektionstyp die durchschnittliche Intensität aus, und klicken Sie auf Okay.
Um die nicht-gleichgewichtende kationische Peptidträger-Knorpeldiffusionsrate zu bewerten, montieren Sie jede Hälfte der Transportkammer, um eine große Gummidichtung, einen Polymethylmethacrylateinsatz und eine kleine Gummidichtung zu umfassen. Messen Sie die Dicke eines Knorpelexplants, legen Sie dann die Explantation in die Brunnen des Kunststoffeinsatzes mit der oberflächlichen Oberfläche, die der vorgelagerten Kammer zugewandt ist, und stecken Sie die beiden Hälften zusammen, um die Montage abzuschließen. Verwenden Sie einen Schraubenschlüssel, um die Hälften fest zusammenzuschrauben, bevor Sie die vorgelagerte Kammer mit zwei Millilitern Protease-Hemmer ergänzenden PBS füllen.
Überprüfen Sie die nachgeschaltete Kammer auf Leckagen aus der vorgelagerten Kammer. Wenn keine Leckage festgestellt wird, füllen Sie die nachgeschaltete Kammer mit zwei Millilitern Proteasehemmer ergänzt PBS. Fügen Sie sowohl den auf- als auch den nachgeschalteten Kammern einen einzigen Mini-Rührbalken hinzu und legen Sie die Kammer auf eine Rührplatte, wobei die Kammer so ausgerichtet ist, dass der Laser des Spektralphotometers in Richtung der Mitte der nachgeschalteten Kammer fokussiert ist.
Sammeln Sie mit dem Signalempfängerteil des Spektralphotometers hinter der nachgeschalteten Kammer mindestens fünf Minuten lang stabile, echtzeit-nachgeschaltete Fluoreszenz-Emissionswerte. Nach dem Erhalt eines stabilen Messwerts fügen Sie der vorgelagerten Kammer ein vorberechnetes Volumen fluoreszierend markierter kationischer Peptidträger-Trägerlösungen zu einer abschließenden Badkonzentration von drei Mikromolaren hinzu, und überwachen Sie das nachgeschaltete Fluoreszenzsignal, während der gelöste Transport eine stetige Steigung skalieren kann. Sobald ein stabiler Zustand erreicht ist, übertragen Sie 20 Mikroliter Lösung aus der vorgelagerten Kammer in die nachgeschaltete Kammer für einen Spike-Test und sammeln Sie die nachgeschalteten Echtzeit-Fluoreszenzwerte.
Eine zu hohe positive Ladung wird die solute Penetration in die oberflächliche Zone begrenzen, da der Träger zu stark an die negativ geladenen Aggrecangruppen der Knorpelmatrix bindet. Umgekehrt dringen Träger, die in der Lage sind, schwache und reversible Ladungswechselwirkungen zu nutzen, durch die tiefe Gewebezone. Ein optimal aufgeladener Arzneimittelträger würde jedoch nicht nur in die tiefen Gewebezonen eindringen, sondern auch eine hohe Intra-Gewebe-Aufnahme aufweisen, die anhand der Fluoreszenzmessungen des Gleichgewichtsbades und des Gewebe-Nassgewichts bestimmt werden kann, wie gezeigt.
Nicht-Gleichgewichtsdiffusionstransportexperimente führen zu einer datengenerierten Kurve mit einer allmählich zunehmenden Steigung. Der anfangse Teil der Kurve stellt eine solute Diffusion durch den Knorpel dar, wenn solute Matrixbindungswechselwirkungen auftreten. Sobald die Gelösten die nachgeschaltete Kammer erreichen, erhöht sich die Neigung der Kurve, wenn die Fluoreszenzwerte im Laufe der Zeit zunehmen.
Dieser zweite Teil der Kurve erreicht dann eine stetige Steigung, die eine gleichmäßige Zustandsdiffusion darstellt. Der X-Abfang einer tangentialen Linie, die am stationären Zustandsteil der Kurve gezeichnet wird, gibt die Zeit an, die benötigt wird, um eine gleichmäßige Zustandsdiffusion oder Tauverzögerung zu erreichen. Nach der Lösungsübertragung von der vorgelagerten in die nachgeschaltete Kammer wird eine Fluoreszenzspitze beobachtet, an der die stabilisierte Fluoreszenzintensität verwendet werden kann, um die Fluoreszenz mit der Konzentration zu korrelieren.
Die repräsentativen effektiven Diffusivitäts- und Steady-State-Diffusionswerte können dann wie angegeben berechnet werden. Beachten Sie, dass die konstante Zustandsdiffusivität zwei Größenordnungen höher ist als die effektive Diffusivität, da alle ladungsbasierten Bindungsstellen belegt sind. So basiert die Diffusion an dieser Stelle auf Größe und nicht auf Ladung, was zu ähnlichen konstanten Konstantendiffusionswerten zwischen CPCs gleicher Größe führt.
Bewahren Sie die Explantationsfeuchte aufrecht und minimieren Sie die Verdunstung der Lösung während des gesamten Experiments, um Veränderungen in der Knorpelmorphologie bzw. der Lösungskonzentration zu verhindern und eine genaue und reproduzierbare Datenerfassung zu gewährleisten. Nach der Entwicklung eines optimal aufgeladenen Arzneimittelträgers können verschiedene Konjugationstechniken eingesetzt werden, um Medikamente für eine verbesserte Gewebeausrichtung zu modifizieren und die Bewertung ihrer biologischen Wirksamkeit zu erleichtern.
