Характеристика транспортных свойств терапевтических средств и их носителей имеет решающее значение для обеспечения эффективных биологических реакций. Эти методы помогают в разработке оптимально заряженных носителей наркотиков для ориентации отрицательно заряженных тканей. Основным преимуществом этих методов является их способность лучше прогнозировать виво терапевтических эффективностей через серию экспериментов in vitro, которые характеризуют растворимый транспорт через ткани.
Хрящевых заболеваний, таких как остеоартрит, остаются необработанными из-за неспособности препаратов проникать в плотную асосудикулярную матрицу хряща, требуя носителей наркотиков пролог терапевтической эффективности. Начните с помощью деликатной задачи протрите, чтобы аккуратно удалить избыток PBS с поверхностей диаметром три миллиметра, один миллиметр толщиной хряща explants. Используйте баланс, чтобы быстро записать мокрый вес каждого explant и немедленно поместить explants в ванну PBS для предотвращения обезвоживания.
Далее добавьте 300 микролитров свежеприготовленных, 30 микромолейных флуоресцентно помеченных катионные пептидные несущего раствора на скважину к внутренним колодцам пластины 96 скважин и используйте шпатель, чтобы добавить по одному экспланту к каждому колодцу раствора. Заполните каждую из окружающих скважин 300 микролитров PBS и накройте пластину крышкой. Печать края пластины с гибкой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение и поместить пластину на шейкер в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 24 часов при 50 оборотов в минуту, с 15-миллиметровой орбиты.
В конце инкубации перенесите равновесную ванну из каждой хорошо в отдельные полипропиленые трубки и сделайте серийные разбавления из запаса 30 микромоляных катиочных пептидных переносчиков для создания стандартной кривой. Затем перенесите 200 микролитров каждого раствора и стандарта в отдельные скважины черной пластины 96 скважин и получите показания флуоресценции каждого образца и стандартные на основе возбуждения и выбросов длин волн флуоресцентной этикетки. Чтобы определить глубину проникновения катионные пептид перевозчика в хрящ эксплантации, использовать скальпель сократить шесть миллиметров диаметром, один миллиметр толщиной хряща explants в два раза и гидрат в результате половины диска штук с ингибитором протея дополнен PBS.
Нанесите эпоксидную смолу на центр колодеца специально разработанной одномерной транспортной камеры и закрепните половину диска в колодец с поверхностной стороной экспланта, обращенной к восходящей стороне камеры. Удалите излишки клея из колодец, чтобы предотвратить контакт с областью поверхности диффузии хряща и добавьте 80 микролитров ингибитора протеазы, дополнив PBS с обеих сторон экспланта. Pipette жидкости вверх и вниз на одной стороне explant, чтобы проверить на утечку на другую сторону.
Если утечки нет, замените ингибитор протеазы, дополненный PBS с восходящей стороны, 80 микролитров 30 микромолярной флуоресценции, помеченной катическим пептидным раствором, и аккуратно поместите транспортную камеру в блюдо клеточной культуры. Обложка базы блюдо с PBS, чтобы избежать катионных пептида несущего раствора испарения. Забота о том, что нет прямого контакта между решениями из камер вверх по течению и вниз по течению.
Поместите покрытое блюдо на шейкер, чтобы ограничить осаждение частиц в течение четырех или 24 часов при комнатной температуре и 50 оборотов в минуту, с 15-миллиметровой орбитой. В конце инкубации, удалить explants из камеры и вырезать около 100 микрон толщиной ломтиками из центра каждого explant. Поместите каждый кусочек explant между стеклянной слайд и крышка скольжения и гидрат ломтики со свежим ингибитором протеазы дополнен PBS.
Зафиксировать слайд на стадии конфокального микроскопа и получить стек флуоресцентных изображений через полную толщину ломтика при увеличении 10X. Откройте файл изображения и изображение J, нажмите изображение, а также выберите стеки и проект из меню высадки. Затем ввемите номера среза от одного до последнего среза и под типом проекции выберите среднюю интенсивность и нажмите Кнопку Хорошо.
Для оценки не равновесной катионической скорости диффузии хряща пептидного носителя, соберите каждую половину транспортной камеры, чтобы включить одну большую резиновую прокладку, одну вставку полиметилметакрилата и одну небольшую резиновую прокладку. Измерьте толщину explant хряща, после этого поместите explant в колодцах пластичной вставки с поверхностной поверхностью смотря на камеру вверх по течению и зажатие 2 половинки совместно для того чтобы завершить агрегат. Используйте гаечный ключ, чтобы плотно винт половинки вместе перед заполнением вверх по течению камеры с двумя миллилитров ингибитора протеазы дополнены PBS.
Проверьте камеру вниз по течению на наличие утечки из камеры вверх по течению. Если утечка не обнаружена, заполните камеру вниз по течению двумя миллилитров ингибитора протеазы, дополненного PBS. Добавьте одну мини-бар для перемешивания как в камеры вверх, так и вниз по течению и поместите камеру на пластину перемешивания с выровненной камерой таким образом, чтобы лазер из спектрофотометра был направлен к центру камеры ниже по течению.
С частью приемника сигнала спектрофотометра за камерой вниз по течению, собирать стабильные, в режиме реального времени вниз по течению флуоресценции показания выбросов, по крайней мере пять минут. После получения стабильного чтения, добавить предварительно рассчитанный объем флуоресцентно помечены катионом пептид перевозчика стокового раствора в вверх по течению камеры к окончательной концентрации ванны три микромолара, и контролировать вниз по течению флуоресцентный сигнал, позволяя растворить транспорта для достижения устойчивого увеличения склона. Как только устойчивое состояние будет достигнуто, перенесите 20 микролитров раствора из камеры вверх по течению в камеру вниз по течению для проверки всплеска и соберите показания флуоресценции в режиме реального времени вниз по течению.
Слишком высокий положительный заряд ограничит проникновение раствора в поверхностную зону, так как носитель слишком сильно связывается с отрицательно заряженными аггреканские группы матрицы хряща. И наоборот, носители, способные воспользоваться слабыми и обратимыми взаимодействиями заряда, проникают через глубокую зону ткани. Оптимально заряженный препарат перевозчик, однако, будет не только проникать в глубокие зоны ткани, но и продемонстрировать высокий внутриматочное поглощение, которое может быть определено с помощью измерений флуоресценции равновесной ванны и влажного веса тканей, как показано на примере.
Не равновесные транспортные эксперименты по диффузии приводят к кривой, генерируемой данными, с постепенно увеличивающейся наклоном. Начальная часть кривой представляет собой растворимое диффузию через хрящ по мере возникновения соляных матричных связывающих взаимодействий. Как только растворы достигают камеры вниз по течению, наклон кривой увеличивается по мере увеличения показаний флуоресценции с течением времени.
Эта вторая часть кривой достигает устойчивого наклона, что представляет собой устойчивую диффузию состояния. X-перехват касательной линии, нарисованной в устойчивой части кривой, указывает время, необходимое для достижения стабильной диффузии состояния или тау-лага. После переноса раствора из восходящего потока в камеру ниже по течению наблюдается всплеск флуоресценции, после чего стабилизированная интенсивность флуоресценции может быть использована для корреляции флуоресценции с концентрацией.
Репрезентативная эффективная диффузивность и устойчивые значения диффузии состояния могут быть рассчитаны, как указано. Обратите внимание, что устойчивая диффуктивность состояния на два порядка выше, чем эффективная диффуктивность в результате того, что все сайты связывания, основанные на заряде, заняты. Таким образом, на данный момент диффузия основана на размере, а не заряда, в результате чего аналогичные устойчивые значения диффузии состояния среди CPCs того же размера.
Поддержание гидратации explant и минимизация испарения раствора на протяжении всего эксперимента, чтобы предотвратить изменения в морфологии хряща и концентрации раствора, соответственно, и обеспечить точное и воспроизводимое получение данных. После разработки оптимально заряженных носителей наркотиков, различные методы спряжения могут быть использованы для модификации препаратов для повышения ориентации тканей и для облегчения оценки их биологической эффективности.
