Este protocolo utiliza grabaciones intracelulares de motoneurones espinales, para investigar directamente la influencia de la estimulación de corriente directa trans-espinal en la función de las redes espinales. La principal ventaja de esta técnica es que permite realizar grabaciones intracelulares en sistemas nerviosos completamente maduros. Facilitar la traducción de las observaciones experimentales a aplicaciones prácticas.
Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, una rata Wistar macho anestesada de seis meses de edad, utilice un microscopio diseccionante y una hoja número 21, para hacer una incisión longitudinal de la piel desde el esternón hasta la barbilla. Y usa la disección contundente para exponer la vena yugular derecha. Coloque dos ligaduras de 4-0 debajo de la sección de la vena sin puntos de ramificación.
Y haz un nudo suelto en el extremo proximal del segmento de la vena. Y un nudo suelto en el extremo distal del segmento. Sujeta la vena proximal al corazón y liga el extremo distal de la vena.
Utilice tijeras de iris para hacer una incisión entre la abrazadera y la ligadura distal. Y, sosteniendo una solapa de la vena, introduzca un catéter precargado hasta el punto donde la vena está bloqueada por la abrazadera. A continuación, retire la abrazadera y empuje el catéter varios milímetros en la vena.
Para una colocación de tubo traqueal, utilice fórceps contundentes para separar las dos glándulas mandibulares que cubren los músculos esternoideos. Y separar los músculos esternohoides en la línea media, para exponer la tráquea. Coloque tres ligaduras de 4-0 debajo de la tráquea y haga dos nudos por debajo del punto de inserción del tubo traqueal y un nudo arriba.
A continuación, inserte un tubo tráqueo en la tráquea por debajo del tercer cartílago traqueal. Y fije el tubo en su lugar con las ligaduras pre-preparadas. Para diseccionar los nervios de las extremidades posteriores, utilice una hoja número 21 para hacer un corte longitudinal en el lado posterior de la extremidad posterior izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.
Y usa tijeras para hacer un corte entre las regiones anterior y posterior de la fosa popliteal, en la parte posterior de la articulación de la rodilla. Corta dos cabezas del bíceps femoris, para exponer el nervio ciático. Y separar la cabeza lateral de la cabeza medial del músculo gastrocnemius, para exponer el nervio tibial y sus ramas.
A continuación, utilice el número 55 fórceps, para diseccionar cuidadosamente el gastrocnemius medial y el gastrocnemius lateral y los nervios del soleo. Desconectarlos de los tejidos circundantes manteniendo su conexión con los respectivos músculos. Para realizar la laminectomía, utilice una hoja número 21 para hacer una incisión longitudinal desde el sacro hasta las vértebras torácicas.
E identificar la vértebra Th13, como un segmento torácico más bajo con una inserción de costilla. Luego usa rongeurs finos para eliminar los procesos espinosos y las láminas de la Th13 a las vértebras L2, para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal. Para fijar la columna vertebral, coloque la rata en un marco hecho a medida en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius, conectada a un sistema de calefacción de bucle cerrado.
Y usa los colgajos de la piel para formar una piscina profunda sobre la médula espinal expuesta. Coloque abrazaderas metálicas por debajo de los procesos transversales Th12, y en los procesos espinosos L3, y llene la piscina con 37 grados Centígrados de aceite mineral. Usa las aletas de la piel para hacer una piscina profunda de aceite mineral sobre los nervios tibial, gastrocnemius medial y gastrocnemius lateral y soleus expuestos.
Y coloque los nervios en electrodos estimulantes de alambre de plata bipolar. A continuación, conecte los electrodos a un estimulador de pulso cuadrado utilizando canales de estimulación separados para cada nervio. Para una colocación de electrodos de superficie, bajo el microscopio de disección, coloque un electrodo de bola de plata en el lado caudal izquierdo de la médula espinal expuesta.
Con un electrodo de referencia insertado en los músculos de la espalda. Y conecte ambos electrodos al amplificador diferencial de CC. Utilice un estimulador de corriente constante para estimular el gastrocnemius medial y los nervios de gastrocnemius lateral y soleo, con pulsos cuadrados de una duración de 0,1 milisegundos repetidos a una frecuencia de tres hercios y observar las voleas aferentes.
Al final de la simulación, mueva el electrodo de superficie rostralmente y repita la estimulación para identificar los segmentos espinales en los que las amplitudes de las voleas son las más altas para cada nervio. Después de determinar la ubicación de la volea máxima, entregue un bloqueador neuromuscular por vía intravenosa para paralizar la rata. Mientras que un asistente conecta el tubo traqueal a un respirador externo en línea con un nominador de tapa compatible con roedores.
Para abrir la dura y la pia mater, utilice el número 55 fórceps para levantar suavemente la dura mater, y corte el tejido caudalmente desde el segmento L5, rostralmente hasta el segmento L4. Luego usa un par de fórceps 5SF ultra delgados, para hacer un pequeño parche en la pia, cubriendo la columna dorsal entre los vasos sanguíneos. Exactamente a nivel de la volea aferente máxima del gastrocnemius medial y el gastrocnemius lateral y el nervio soleus.
Para colocar los electrodos de estimulación de corriente directa trans-espinal, coloque una esponja empapada de solución salina en el lado dorsal de las vértebras Th12. Y utilice la manipulación fina para presionar la esponja con un electrodo de estimulación de corriente directa trans-espinal activo. A continuación, monte un microelectrodo agrupado personalizado, en el micro manipulador, lo que permite un movimiento de paso de una a dos micras y calibración estereotaxia.
Y conducir una punta de micropipeta en un parche seleccionado en la pia, en un ángulo lateral medial de 15 a 20 grados. Para registrar la membrana del motoneuron y las propiedades de disparo, en el modo puente del amplificador intracelular, estimular las respectivas ramas nerviosas para identificar la motoneuron sobre la base de la apariencia de todo o nada, del potencial de acción antidrómica. En el modo de abrazadera de corriente discontinua del amplificador intracelular con un modo de velocidad de conmutación de corriente de cuatro a ocho kilohercios, utilice un pulso de corriente despolarizante intracelular de 0,5 milisegundos, para evocar un potencial de acción de ortodoncia, en el motoneuron.
Para calcular la resistencia de entrada celular, estimule un motoneuron, con 40 pulsos cortos de 100 milisegundos de hiperpolarización de una corriente de nanogramos. Para determinar el valor base real como la amplitud mínima de la corriente despolarizante necesaria para provocar un solo pico, estimule una motoneuron con pulsos de onda cuadrada de 50 milisegundos en amplitudes crecientes. A continuación, inyecte pulsos de onda cuadrada de 500 milisegundos de corriente despolarizante, a amplitudes crecientes.
En 0.1 a dos pasos de nano amplificadores, para evocar descargas rítmicas de motoneurones. Para una estimulación de corriente directa trans-espinal, iniciar los procedimientos de polarización mediante la aplicación trans-espinal de corriente directa, manteniendo una penetración estable de la motoneuron. Aquí, se muestra un potencial de acción ortotrópico típico, evocado por la estimulación intracelular que cumple con todos los criterios para la inclusión de datos.
En este análisis, una respuesta celular a un pulso de corriente hiperpolarizante de 100 milisegundos de un nanograma. A partir de la cual se puede observar tanto la resistencia de entrada de pico como de meseta de un motoneuron a partir de la desviación de voltaje. Esta traza de voltaje ampliada de un pico básico real, exhibe un umbral de voltaje claramente marcado del pico.
Indicando el nivel de despolarización de membrana en el que se activan los canales de sodio cerrados de tensión para iniciar el potencial de acción. Estos gráficos proporcionan ejemplos de trazas de voltaje intracelular. A partir de dos motoneurones, estimulado intracelularmente con pulsos cuadrados de 500 milisegundos de corriente despolarizante.
Antes, durante y después de una aplicación de estimulación de corriente directa trans-espinal. Se encontró que la estimulación de corriente directa trans-espinal anodal actúa hacia un aumento de la excitabilidad de motoneuron y frecuencias más altas de disparo rítmico. Mientras que la estimulación de corriente directa trans-espinal cathodal, actuó para evitar la inhibición de la cocción.
Además, los efectos de ambos tipos de estimulación de corriente directa trans-espinal, duraron más que el período de polarización. Los datos inexactos pueden ser adquiridos, si los criterios de inclusión de datos se ven comprometidos debido a la penetración celular imperfecta. Un fracaso para compensar la resistencia y capacitancia del microelectrodo o una inestabilidad de la médula espinal.
Es imperativo que no se dañe la médula espinal durante la disección, ya que la lesión puede resultar en shock espinal, haciendo que las grabaciones adicionales sean imposibles. Es posible recolectar muestras de tejido para un análisis químico histológico o inmunocito. Por ejemplo, la medición de la expresión c-fos se puede utilizar como proxy de actividad neuronal.
