La detección de fitopatógenos es un paso crucial en el manejo de enfermedades vegetales. Este protocolo proporciona un método de detección rápida para la contaminación del agua de riego debido a un patógeno común de combate a base de agua. Usando esta técnica, un patógeno específico, como Phytophthora capcici, puede ser procesado y rápidamente detectado a partir de nuestro gran volumen de agua de riego mientras permanece en el lugar.
Demostrando el procedimiento estará Owen Hudson, un estudiante de maestría de mi laboratorio, y Sumyya Waliullah, una investigadora postdoctoral del laboratorio del Dr.Pingxi G para instalar una bomba y un filtro para la detección en el sitio Phytophthora capcici en agua de riego. Coloque un matraz filtrante en un tubo conectado a una bomba manual y el embudo de buchner instalado en el tapón de goma en la boca del matraz de filtrado. A continuación, coloque un pedazo de papel de filtro de tamaño adecuado con un tamaño de retención de 15 micras en el embudo.
Para obtener muestras de agua, recoja agua de riego de la fuente objetivo. El agua puede tener pequeñas cantidades de escombros, pero no sedimentos o suelos significativos. Vierta lentamente entre 50 y 1000 mililitros de agua de prueba sobre el papel de filtro dentro del embudo mientras usa la bomba manual para crear una succión para tirar del agua a través del embudo.
Cuando se haya filtrado toda el agua, utilice fórceps para retirar el papel de filtro del embudo. Y usa tijeras estériles para cortar el papel en trozos pequeños. Sumerja de ocho a 12 trozos de papel en 400 microlitros de tampón de extracción en un tubo de 1,5 mililitros para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.
Vórtice o agitar el papel durante 10 segundos una vez cada minuto. Al final de la incubación, utilice fórceps para retirar el papel con el menor tampón posible. Y repita la licencia con el siguiente conjunto de piezas de papel de filtro.
Para la extracción de ADN de las muestras de papel de filtro se añadieron 20 microlitros de proteinasa K y 10 microlitros de 10 nanogramos por microlitro RNAs a la muestra también e incubar la solución a temperatura ambiente durante 15 minutos con vórtice o temblor cada tres minutos. Al final de la incubación, añadir 500 microlitros de cuentas magnéticas en tampón de unión a la muestra y mezclar bien agitando. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque el tubo y el bastidor separador magnético durante dos minutos antes de retirar y desechar el sobrenadante.
Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender vigorosamente las perlas en 500 microlitros de tampón de lavado. Después de 30 segundos, devuelva el tubo al imán y espere dos minutos antes de desechar el sobrenadante. Repita el lavado con 500 microlitros de tampón de lavado también y 500 microlitros de 80% etanol como se acaba de demostrar.
Y el aire impulsa el pellet de cuentas magnéticas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación re-suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de elución con pipeteo durante un minuto antes de colocar el tubo de nuevo en el imán durante dos minutos para permitir la recolección del sobrenadante. Después de preparar la mezcla de imprimación LAMP como se indica en la tabla, añadir a 2,5 microlitros de imprimación mezclar 12,5 microlitros de una lava LAMP mastermix un microlitros de ADN extraído y nueve microlitros de agua destilada doble a un tubo PCR y configurar un control positivo y uno negativo.
incubar todas las muestras en un blog de calor de 64 grados Celsius durante 45 minutos o el instrumento de amplificación genie tres al final de la incubación, una carga de cinco microlitros de cada muestra amplificada en un gel de 1% de agarosa e imagen de las bandas resultantes en una máquina de imágenes ultravioletas. Si se utilizó un tinte calorimétrico, vea el cambio de color para determinar los resultados como positivos o negativos. Si se utilizó un instrumento de amplificación portátil, vea el gráfico de amplificación en la pantalla para determinar los resultados.
El tiempo óptico para ejecutar el ensayo LAMP a 64 grados es de 45 minutos, ya que las concentraciones más bajas que fueron positivas para la detección no se amplifican hasta 40 minutos, mientras que las concentraciones más altas se amplifican a 20 minutos. La amplificación se puede confirmar en un gel de 1% de agarosa etiquetado con una mancha de ácido nucleico. Como se ilustra, la PCR convencional es 40 veces menos sensible que LAMP.
Detectar 4,8 veces 10 a las terceras zoosporas por mililitro concentraciones en la más baja. En este análisis, se recogieron muestras de agua de siete estanques utilizados para la producción comercial de vegetales en el condado de Tift, Georgia. Tres de los cuales demostraron resultados positivos de LAMP.
Sin embargo, cuando las muestras fueron analizadas por PCR convencional, las zoosporas sólo se detectaron en una de las tres muestras positivas. En esta tabla, se resumen las diferencias entre los métodos de detección que utilizan variables como la sensibilidad, el tiempo, la preparación necesaria, los materiales y el costo. LAMP es el método menos costoso entre los métodos probados, y también es el más rápido, requiriendo sólo 30 a 60 minutos para la amplificación en comparación con la amplificación PCR convencional.
El uso de este protocolo de ADN extraído de patógenos de semillas UMI estrechamente relacionados da como resultado ninguna detección de ninguna de las muestras, lo que confirma la especificidad de las imprimaciones. Asegúrese de no verter el agua de la muestra demasiado rápido y tenga cuidado al agregar ADN extraído a los tubos LAMP para limitar la contaminación. Una vez que se han desarrollado otros patógenos transmitidos por el agua, los métodos de filtración y ácido de la lámpara pueden adaptarse para otros patógenos.
