Fitopatojen tespiti bitki hastalıkları nın yönetiminde önemli bir adımdır. Bu protokol, ortak bir su kaynaklı avcı patojeni nedeniyle sulama suyu kirlenmesi için hızlı bir algılama yöntemi sağlar. Bu teknik kullanılarak, Phytophthora capcici gibi spesifik patojen, yerinde kalırken, sulama suyunun büyük hacminden işlenebilir ve hızlı bir şekilde tespit edilebilir.
Prosedürü gösteren Owen Hudson, benim laboratuvardan bir Master öğrencisi ve Sumyya Waliullah, Dr.Pingxi G laboratuvarından bir PostDoctoral araştırmacı sulama suyunda yerinde Phytophthora capcici algılama için bir pompa ve filtre kurmak olacaktır. Bir el pompasına bağlı bir tüpe bir filtreleme şişesi takın ve filtreleme şişesinin ağzındaki kauçuk durdurucuya buchner hunisi takın. Daha sonra huni içine 15 mikron tutma boyutu ile uygun büyüklükte bir filtre kağıdı parçası takın.
Su numuneleri elde etmek için hedeflenen kaynaktan sulama suyu toplanır. Su enkaz küçük miktarlarda olabilir, ama önemli bir tortu veya toprak. Huni den su çekmek için bir emme oluşturmak için el pompası kullanırken yavaş yavaş huni içinde filtre kağıdı üzerinde test suyu 50 ila 1000 mililitre arasında dökün.
Tüm su filtrelendiğinde, filtre kağıdını huniden çıkarmak için forcep kullanın. Ve küçük parçalar halinde kağıt kesmek için steril makas kullanın. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için 1,5 mililitrelik bir tüpte 400 mikrolitre ekstraksiyon tamponuna 8 ila 12 adet kağıt batırın.
Girdap veya başka bir kez her dakika 10 saniye boyunca kağıt ajite. Kuluçka sonunda, mümkün olduğunca az tampon ile kağıt kaldırmak için forceps kullanın. Ve lisansı bir sonraki filtre kağıdı parçaları kümesiyle tekrarlayın.
Filtre kağıdı ndan DNA çıkarma numuneleri 20 mikrolitre proteinaz K ve 10 mikrolitre mikrolitre 10 mikrolitre mikrolitre RNA'lar başına numuneye de eklenir ve çözeltiyi her üç dakikada bir girdap veya sallayarak 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, numuneye bağlama tampon500 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve sallayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, süpernatant çıkarmadan önce iki dakika boyunca tüp ve manyetik ayırıcı raf yerleştirin.
Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 500 mikrolitre yıkama tamponu yla boncukları şiddetle yeniden askıya alın. 30 saniye sonra mıknatıs için tüp dönmek ve supernatant atmadan önce iki dakika bekleyin. 500 mikrolitre yıkama tamponu ve 500 mikrolitre %80 etanol ile yıkayın.
Ve hava manyetik boncuk peletini oda sıcaklığında 15 dakika sürer. Kuluçka sonunda yeniden supernatant toplanması sağlamak için iki dakika için mıknatıs üzerine tüp geri yerleştirmeden önce bir dakika boyunca borulama ile elüsasyon tampon 50 mikrolitre boncuk askıya. Lamp astar karışımını masada belirtildiği gibi hazırladıktan sonra, 2,5 mikrolitre astar karışımı 12,5 mikrolitre bir lav LAMP mastermix bir mikrolitre çıkarılan DNA ve dokuz mikrolitre çift distile su pcr tüp ve bir pozitif ve bir negatif kontrol kurmak ekleyin.
tüm numuneleri 45 dakika boyunca 64 derece lik bir ısı blogunda veya kuluçka sonunda cin üç amplifikasyon aletinde, her güçlendirilmiş numuneden beş mikrolitrelik bir yükü %1'lik agarose jelüzerine kuluçkaya yatırın ve ultraviyole görüntüleme makinesinde ortaya çıkan bantları görüntüleyin. Kalorimetrik boya kullanıldıysa, sonuçları pozitif veya negatif olarak belirlemek için renk değişikliğini görüntüleyin. Taşınabilir bir amplifikasyon aleti kullanıldıysa, sonuçları belirlemek için ekrandaki amplifikasyon grafiğini görüntüleyin.
LAMP testinin 64 derecede çalıştırılmak için optik süresi 45 dakikadır, çünkü algılama için pozitif olan en düşük konsantrasyonlar 40 dakikaya kadar yükseltimezken, daha yüksek konsantrasyonlar 20 dakikada yükseltilir. Amplifikasyon bir Nükleik asit lekesi ile etiketlenmiş bir% 1 agarose jel üzerinde teyit edilebilir. Gösterildiği gibi geleneksel PCR LAMP'den 40 kat daha az hassastır.
Mililitre konsantrasyonları başına 4.8 kez 10 kez tespit en düşük. Bu analizde Gürcistan'ın Tift İlçesi'nde ticari sebze üretimi için kullanılan yedi göletten su örnekleri toplanmıştır. Bunlardan üçü olumlu LAMP sonuçları gösterdi.
Ancak numuneler konvansiyonel PCR tarafından test edildiğinde, zoosporlar üç pozitif örnekten sadece birinde tespit edildi. Bu tabloda duyarlılık, zaman, gerekli hazırlık, malzeme ve maliyet gibi değişkenleri kullanan algılama yöntemleri arasındaki farklar özetlenmiştir. LAMP test edilen yöntemler arasında en ucuz yöntemdir ve aynı zamanda en hızlı, geleneksel PCR amplifikasyon ile karşılaştırıldığında amplifikasyon için sadece 30 ila 60 dakika gerektiren.
Bu protokolün kullanılması, yakından ilişkili UMI tohum patojenlerinden elde edilen DNA, örneklerin hiçbirinde tespit edilmeyerek astarların özgüllüğünü doğrular. Numune suyunu çok hızlı dökmediğinizden emin olun ve kontaminasyonu sınırlamak için LAMP tüplerine çıkarılan DNA eklerken dikkatli olun. Diğer su kaynaklı patojenler kendi özel astar setleri geliştirilmiş olması, filtrasyon ve lamba asit yöntemleri diğer patojenler için adapte edilebilir.
