植物病原菌の検出は、植物疾患管理の重要なステップです。このプロトコルは、一般的な水媒介性戦闘機の病原体による灌漑水汚染の迅速な検出方法を提供します。この技術を用いて、フィトフトーラ・カプチチのような特定の病原体を、現場に残したまま大量の灌漑水から処理し、迅速に検出することができる。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生であるオーウェン・ハドソンと、灌漑水中のフィトフトラカプチシ検出のポンプとフィルターを設置するPingxi G博士の研究室の博士研究員であるスミヤ・ワリウラです。ハンドポンプに接続されたチューブにフィルターフラスコを取り付け、フィルターフラスコの口の中のゴム栓にバフナー漏斗を取り付けます。次に、15ミクロンの保持サイズの適切なサイズのフィルターペーパーを漏斗に収めます。
水サンプルを得るために、ターゲット源から灌漑水を収集します。水には少量の破片が含まれていることがありますが、重要な堆積物や土壌はありません。ハンドポンプを使用して漏斗を通して水を引き出すために吸引を作成しながら、漏斗内の濾紙の上に試験水の50〜1000ミリリットルの間でゆっくりと注ぎます。
すべての水がろ過されたら、漏斗から濾紙を取り除くために鉗子を使用する。そして、小さく紙をカットするために滅菌はさみを使用してください。1.5ミリリットルチューブに8~12枚の紙を1.5ミリリットルチューブに浸し、室温で5分間インキュベーションします。
渦またはそれ以外の場合は、毎分1回10秒間紙を攪拌します。インキュベーションの最後に、鉗子を使用して、できるだけ少ないバッファーで紙を取り除きます。そして、次のフィルター用紙の一部でライセンスを繰り返します。
フィルターペーパーサンプルからのDNA抽出のために、20マイクロリットルのプロテイナーゼKと1マイクロリットル10ナノグラムの10マイクロリットルをサンプルに加え、3分ごとに渦または揺れで15分間室温で溶液をインキュベートした。インキュベーションの終わりに、結合バッファーに500マイクロリットルの磁気ビーズをサンプルに加え、振ることによってよく混ぜます。室温で5分後、上清を取り外して捨てる前に、チューブと磁気セパレータラックを2分間置きます。
磁性分離器からチューブを取り外し、500マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを激しく再懸濁します。30秒後にチューブを磁石に戻し、上清を捨てる前に2分間待ちます。ちょうど実証したように、洗浄バッファーの500マイクロリットルと80%エタノールの500マイクロリットルで洗浄を繰り返します。
そして、空気は室温で15分間磁気ビーズペレットを駆動します。インキュベーションの終わりに、上清の収集を可能にするために2分間磁石にチューブを戻す前に、1分間ピペット処理で50マイクロリットルの溶出バッファーでビーズを再中断します。表に示されているようにLAMPプライマーミックスを準備した後、2.5マイクロリットルのプライマーミックスの12.5マイクロリットルの溶岩LAMPマスターミックスで、抽出されたDNAの1マイクロリットルと2マイクロ蒸留水9マイクロリットルをPCRチューブに加え、1つの正と1つの陰性対照を設定します。
64°Cの熱ブログですべてのサンプルを45分間、またはインキュベーション終了時に魔神3増幅器にインキュベートし、各増幅サンプルの5マイクロリットルを1%アガロースゲルに負荷し、得られたバンドを紫外線イメージングマシンで画像化します。熱量染料を使用した場合は、色の変化を表示して結果を正または負の値で判断します。ポータブル増幅器を使用した場合は、画面に増幅グラフを表示して結果を確認します。
LAMPアッセイを64度で実行する光学時間は45分であり、検出に陽性であった最も低い濃度は40分まで増幅されず、20分でより高い濃度が増幅される。増幅は、核酸染色で標識された1%アガロースゲルで確認することができる。従来のPCRはLAMPに比べて40倍低感度に図示されている。
最も低いミリリットル濃度当たり第3の動物園の胞子に4.8回10回検出する。この分析では、ジョージア州ティフト郡の商業野菜生産に使用される7つの池から水サンプルを採取した。そのうちの3つは正のLAMP結果を示した。
しかし、サンプルが従来のPCRで試験されたとき、3つの陽性サンプルのうちの1つだけでZoosporeが検出された。この表では、感度、時間、必要な準備、材料、コストなどの変数を用いた検出方法の違いについてまとめたものです。LAMPは、試験された方法の中で最も安価な方法であり、また最速であり、従来のPCR増幅と比較して増幅のために30〜60分しか必要としなくてはないほどです。
このプロトコルを使用して、密接に関連するUMI種子病原体から抽出されたDNAは、どのサンプルも検出しなくず、プライマーの特異性を確認する。サンプル水を速く注ぎすぎないようにし、抽出したDNAをLAMPチューブに添加して汚染を制限する際には注意してください。他の水媒介病原体が特定のプライマーセットを開発したら、ろ過およびランプ酸法を他の病原体に適合させることができる。
