Este protocolo cuantifica los flujos de calcio en las neuronas dopaminérgicas, que se pierden en la enfermedad de Parkinson. Esto es útil para entender cómo el calcio anormal causa la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson. Por primera vez, demostramos flujos espontáneos de calcio en las neuronas primarias cultivadas de cerebro medio.
Este método se puede utilizar para diseccionar las contribuciones específicas de los receptores implicadas en la apoptosis mediada por calcio. Nuestro método proporciona una vía para las pantallas de fármacos de alto contenido para descubrir compuestos neuroprotectores específicos y eficaces para la enfermedad de Parkinson. Estos compuestos neuroprotectores evitarían la apoptosis mediada por calcio en la neurona dopaminérgica.
Comience preparando un mililitro de medio DMEM sin suero con un microlitro de AAV hSyn-GCaMP6f por plato. Aspirar el medio de cultivo celular de cada plato y reemplazarlo por un mililitro del DMEM preparado con hSyn-GCaMP6f. Coloque los platos de nuevo en la incubadora de 37 grados Centígrados durante una hora.
Después de la incubación, aspirar el medio con AAVs y reemplazarlo por tres mililitros de medio de cultivo celular. Incubar los platos a 37 grados centígrados durante cinco a siete días. Cambiar el medio cada dos o tres días a lo largo de este período de infección viral.
Prepare un litro del tampón de grabación HEPES, 200 mililitros de 20 tampones de grabación de glutamato micromolar y 200 mililitros de búfer de grabación NBQX de 10 micromolares según las instrucciones del manuscrito. Llene una placa estéril de 35 milímetros de Petri con tres mililitros del tampón de grabación. Tome el plato de Petri con los cultivos infectados de la incubadora, luego agarre cuidadosamente el borde de un resbalón de cubierta con fórceps de punta fina y transfiéralo al plato con el tampón de grabación.
Coloque el resguardo de la cubierta restante en el medio de nuevo en la incubadora de 37 grados Celsius y transporte el plato con tampón de grabación al microscopio confocal. Inicie el software de imágenes. Mientras se está inicializando, inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación.
A continuación, calibrar el flujo a dos mililitros por minuto. Transfiera el resbalón de la cubierta infectada del plato Petri al baño de grabación con fórceps finos. Usando el objetivo de inmersión de agua 10X y la luz de campo brillante, busque el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos celulares de neuronas, luego cambie al objetivo 40X y reenfoque la muestra.
Seleccione y aplique AlexaFluor 488 en la ventana de lista Tintes. Con el fin de evitar la sobreexposición y el blanqueo fotográfico de los fluoróforos, comience con ajustes de baja potencia HV y láser. Para el canal AlexaFluor 488, establezca el HV en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento a cero.
Establezca la potencia en 5% para la línea láser 488. Aumente el tamaño del agujero a 300 micrómetros y utilice la opción de escaneo de enfoque x2 para ajustar de forma óptima las señales de emisión a los niveles de subsaturación. Los ajustes se pueden ajustar para una visibilidad óptima de cada canal.
Una vez optimizados los ajustes del microscopio, mueva el escenario para localizar una región con varias células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia GCaMP6f y concéntrese en el plano deseado para la toma de imágenes. Utilice la herramienta Rectificar clip para recortar el fotograma de imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de un segundo. Establezca la ventana de intervalo en un valor de 1.0 y la ventana Num en 600.
Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción Tiempo y, a continuación, utilice la opción de escaneo Xyt para comenzar la creación de imágenes. Observe la barra de progreso de la imagen y mueva la línea desde el búfer de grabación HEPES al búfer de grabación de glutamato micromolar en el punto de tiempo adecuado. Cuando se complete la creación de imágenes, seleccione el botón de la serie realizada y guarde la película de la serie t terminada.
Continúe perfundiendo el glutamato durante cinco minutos adicionales para que el cultivo de las neuronas haya estado expuesto al glutamato durante un total de 10 minutos. Repita este proceso para cada hoja de portada que se va a tomar la imagen. Es posible ver rastros de calcio y cuerpos celulares neuronales inmediatamente después del experimento.
Utilice la herramienta Elipse para dibujar el número deseado de ROI alrededor del soma neuronal. Y utilice el botón Análisis de serie para visualizar las trazas. Después de la exposición adicional de cinco minutos al glutamato, retire el resbalón de la cubierta del baño con fórceps finos y colóquelo de nuevo en la placa Petri con el búfer de grabación hasta que se completen todas las imágenes.
El día de la toma de imágenes, los cultivos de VM fueron tratados con glutamato o una combinación de glutamato y NBQX. En ambas condiciones, se observaron cambios heterogéneos y espontáneos en la florescencia de GCaMP6f que indicaron flujos espontáneos de calcio. La aplicación del glutamato generó una respuesta de calcio robusta y sostenida en las neuronas espontáneamente activas y en reposo.
La aplicación de NBQX redujo la actividad espontánea y bloqueó parcialmente la respuesta del glutamato. La medida en que la aplicación de glutamato estimuló una respuesta de calcio en cada condición se cuantificó utilizando el área debajo de la curva, la amplitud máxima y la latencia para responder. La latencia a la respuesta aumentó bajo la condición nbQX y glutamato.
Para medir la apoptosis mediada por glutamato, las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-Caspasa-3. La intensidad media de la caspasa-3 fue significativamente mayor en ambas condiciones de tratamiento en comparación con los controles no tratados. Un análisis más exhaustivo de la muerte de células tóxicas excitadas se puede hacer contando el número de inmunosustina hidroxilasa positivas neuronas dopaminérgicas en control y condición tratada con glutamato.
Esta técnica ha allanado el camino para entender las contribuciones relativas de diferentes receptores y canales de hierro involucrados en la apoptosis mediada por calcio en la neurona dopaminérgica.
