Dieses Protokoll quantifiziert Kalziumflüsse in dopaminergen Neuronen, die bei der Parkinson-Krankheit verloren gehen. Dies ist nützlich, um zu verstehen, wie abnormes Kalzium dopaminergen Neuronenverlust bei der Parkinson-Krankheit verursacht. Zum ersten Mal zeigen wir spontane Kalziumflüsse in kultivierten primären Midbrain-Neuronen.
Diese Methode kann verwendet werden, um bestimmte Rezeptor-Beiträge zu sezieren, die an der Calcium-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Unsere Methode bietet eine Möglichkeit für hochhaltige Arzneimittel-Screens, um spezifische und effektive neuroprotektive Verbindungen für die Parkinson-Krankheit zu entdecken. Diese neuroprotektive Verbindungen würden Kalzium-vermittelte Apoptose in dopaminergen Neuron verhindern.
Beginnen Sie mit der Zubereitung eines Milliliters serumfreiem DMEM-Medium mit einem Mikroliter hSyn-GCaMP6f AAV pro Schale. Das Zellkulturmedium aus jedem Gericht ansaugen und durch einen Milliliter des vorbereiteten DMEM durch hSyn-GCaMP6f ersetzen. Legen Sie das Geschirr für eine Stunde wieder in den 37 Grad Celsius Brutkasten.
Nach der Inkubation das Medium mit AAVs aspirieren und durch drei Milliliter Zellkulturmedium ersetzen. Die Gerichte fünf bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wechseln des Mediums alle zwei bis drei Tage während dieser Periode der Virusinfektion.
Bereiten Sie einen Liter des HEPES-Aufnahmepuffers, 200 Milliliter 20 Mikromollar-Glutamat-Aufzeichnungspuffer und 200 Milliliter 10 Mikromolar-NBQX-Aufnahmepuffer nach Manuskriptanweisungen vor. Füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Petrischale mit drei Millilitern des Aufnahmepuffers. Nehmen Sie die Petrischale mit den infizierten Kulturen aus dem Brutkasten, dann schnappen Sie sich vorsichtig die Kante eines Deckelschlupfes mit feinen Spitzenzangen und übertragen Sie sie mit dem Aufnahmepuffer in die Schale.
Legen Sie den restlichen Deckelschlupf in Medium zurück in den 37 Grad Celsius Inkubator und transportieren Sie die Schale mit Aufnahmepuffer zum konfokalen Mikroskop. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware. Während der Initialisierung starten Sie die peristaltische Pumpe und platzieren Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer.
Dann kalibrieren Sie den Durchfluss auf zwei Milliliter pro Minute. Übertragen Sie den infizierten Deckelschlupf von der Petrischale in das Aufnahmebad mit feiner Zange. Mit dem 10X Wasser-Immersion-Objektiv und hellfeldlicht, finden Sie die Ebene des Fokus und suchen Sie nach einer Region mit einer hohen Dichte von Neuronen-Zellkörpern, dann wechseln Sie zum 40X-Objektiv und fokussieren Sie die Probe neu.
Wählen Sie AlexaFluor 488 im Listenfenster Farbstoffe aus und wenden Sie es an. Um Überbelichtung und Photobleichung der Fluorophore zu verhindern, beginnen Sie mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Für den AlexaFluor 488 Kanal stellen Sie den HV auf 500, den Gewinn auf 1x und den Offset auf Null.
Stellen Sie die Leistung für die 488-Laserlinie auf 5 % ein. Erhöhen Sie die Lochgröße auf 300 Mikrometer und verwenden Sie die Option Fokus x2-Scanning, um Emissionssignale optimal an die Subsättigung anzupassen. Die Einstellungen können dann für eine optimale Sichtbarkeit jedes Kanals angepasst werden.
Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie die Bühne, um einen Bereich mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Veränderungen in der GCaMP6f-Fluoreszenz anzeigen, und konzentrieren Sie sich auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung. Verwenden Sie das Clip-Korrekturwerkzeug, um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Frameintervall von knapp einer Sekunde erreichen kann. Legen Sie das Intervallfenster auf den Wert 1,0 und das Num-Fenster auf 600 fest.
Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option Zeit aus, und verwenden Sie dann die Option Xyt-Scan, um mit der Bildgebung zu beginnen. Beobachten Sie die Bildfortschrittsleiste und verschieben Sie die Linie aus dem HEPES-Aufnahmepuffer zum entsprechenden Zeitpunkt in den 20 Mikromolaren-Glutamat-Aufzeichnungspuffer. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche "Serie fertig" aus, und speichern Sie den fertigen T-Series-Film.
Setzen Sie das Glutamat für weitere fünf Minuten fort, so dass die Kultur der Neuronen Glutamat für insgesamt 10 Minuten ausgesetzt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abdeckbeleg, der abgebildet werden soll. Es ist möglich, Kalziumspuren und neuronale Zellkörper unmittelbar nach dem Experiment zu sehen.
Verwenden Sie das Ellipse-Tool, um die gewünschte Anzahl von ROIs um das neuronale Soma zu zeichnen. Und verwenden Sie die Schaltfläche Serienanalyse, um die Ablaufverfolgungen zu visualisieren. Nach der zusätzlichen fünfminütigen Exposition gegenüber Glutamat den Deckelschlupf mit feiner Zange aus dem Bad nehmen und mit dem Aufnahmepuffer wieder in die Petrischale legen, bis alle Bildgebung abgeschlossen ist.
Am Tag der Bildgebung wurden die VM-Kulturen entweder mit Glutamat oder einer Kombination aus Glutamat und NBQX behandelt. Unter beiden Bedingungen wurden heterogene und spontane Veränderungen der GCaMP6f-Blütenstand beobachtet, die auf spontane Kalziumflüsse hindeuten. Die Anwendung von Glutamat erzeugte eine robuste und anhaltende Kalziumreaktion sowohl in spontan aktiven als auch in stillen Neuronen.
Die Anwendung von NBQX reduzierte die spontane Aktivität und blockierte teilweise die Glutamatreaktion. Das Ausmaß, in dem die Glutamatanwendung eine Kalziumreaktion in jeder Erkrankung stimulierte, wurde anhand des Bereichs unter der Kurve, der Spitzenamplitude und der Latenz quantifiziert, um zu reagieren. Die Latenz auf die Reaktion nahm unter dem NBQX- und Glutamatzustand zu.
Zur Messung der Glutamat-vermittelten Apoptose wurden die Zellen fixiert und mit einem Anti-Caspase-3-Antikörper befleckt. Die mittlere Caspase-3-Intensität war bei beiden Behandlungsbedingungen signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollen. Eine gründlichere Analyse des angeregten toxischen Zelltodes kann durch Zählen der Anzahl der Immunstain-Tyrosin-Hydroxylase positive dopaminerge Neuronen in der Kontrolle und Glutamat behandelt Zustand durchgeführt werden.
Diese Technik hat den Weg für das Verständnis der relativen Beiträge der verschiedenen Rezeptoren und Eisenkanäle an Kalzium-vermittelte Apoptose in dopaminergen Neuron beteiligt geebnet.
